ZIF-8 負載的吲哚菁綠光熱治療常見菌感染的研究

魯旭，杜亭亭，方遠，王曉敏

（1.天津醫科大學總醫院保健醫療部，天津300052；2.天津科技大學食品科學與工程學院，食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457；3.天津中醫藥大學中西醫結合學院，天津 301617）

致病菌侵入宿主后，所產生的毒素和其他代謝產物能夠引起局部或全身性感染[1]，嚴重情況下可造成膿毒血癥、感染性休克等并發癥，是造成全球范圍內人類死亡的主要原因之一。全球每年超200萬人因大腸桿菌（E.coli）感染死亡[2]，約20%的細菌性食物中毒由金黃色葡萄球菌（S.aureus）引起[3]。抗生素作為目前治療細菌感染類疾病的首選藥物，因過度使用和濫用，導致抗生素耐藥菌株的出現，對人類健康造成了更大的威脅，敦促替代治療手段加速普及。近年來，光熱治療（PTT）為抗菌治療提供了新的途徑。PTT 是通過光熱試劑在近紅外激光照射下，有效地將光能轉化為熱能并造成局部過熱，從而殺死病原體，與傳統抗菌方法相比，有效規避了細菌耐藥性問題并能實現多策略協同治療[4]。光熱試劑吲哚菁綠（ICG）是一種具有較高的光熱轉換效率的兩親性碳菁染料，廣泛應用于光熱治療[5]、光動力治療[6]和熒光實時成像[7]等領域。然而ICG 極易受生理條件下分子自聚集和近紅外照射下光熱降解等因素干擾而大幅降低自身治療性能[8]，嚴重制約了其實際應用前景，改良方案卻鮮有報道。類沸石咪唑酯骨架材料（ZIF）是一種具有四面體拓撲構型的類沸石結構材料，由Zn 或Co 與咪唑類配體組成[9]，化學穩定性高，在高溫及水環境下可以保持穩定的框架結構[10]。為此，本研究選擇具有良好穩定性、生物相容性、低細胞毒性的金屬有機框架材料ZIF-8 負載ICG，通過便捷一步法構建出PTT 性能穩定優良的ZIF-8@ICG 納米復合顆粒，在治療E.coli和S.aureus等常見菌感染的驗證實驗中展現理想效果，為ICG 的臨床應用提供了有效思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

ICG（純度為99%）購于西格瑪奧德里齊公司；無水乙醇、無水甲醇（天津化學試劑一廠）；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌（北京鼎國生物技術公司）；六水合硝酸鋅（上海麥克林生化試劑有限公司）；二甲基咪唑（上海阿拉丁科技有限公司）；NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4（國藥集團化學試劑有限公司）；酵母提取物、胰蛋白胨（青島海博生物科技有限公司）。

1.1.2 主要儀器

紅外熱像儀（FLIR E50，東方嘉儀電子科技有限公司）；近紅外光熱轉換裝置（FC-808，上海熙隆光電科技有限公司）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌（DF-101D，鞏義市予華儀器有限責任公司）；UV-vis 吸收光譜儀（UV-1800，島津公司）；恒溫震蕩箱（HAQ-F，哈爾濱東聯電子技術有限公司）；微量臺式高速離心機（H1650-W，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；渦旋振蕩器（MX-S，Scilogex）；超聲波清洗機（SB-120DT，寧波新芝生物科技股份有限公司）；超純水系統（Millipore Milli-Q，Elix Technology Inside）；電子分析天平（BT25S，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）

1.2 方法

1.2.1 ZIF-8@ICG 納米復合顆粒的制備

用分析天平精確稱取0.05 g 的ICG 和0.148 g 的六水合硝酸鋅，加入10 ml 甲醇溶液。將其放到超聲處理裝置中使其充分溶解，得到溶液A。用分析天平精確稱取0.328 g 二甲基咪唑和0.05 g 的ICG，加入10 ml 甲醇溶液，將其放到超聲處理裝置中使其充分溶解，得到溶液B。然后將溶液B 在室溫條件下倒入溶液A 中，將其放置于攪拌速度為600 rpm 的磁力攪拌器上，在室溫下攪拌1.5 h 充分反應。將產物放到離心機中，經11 000 rpm 離心5 min 后，用無水甲醇洗滌數次，得到綠色ZIF-8@ICG 粉末（0.43 g；產率93.5%）。

1.2.2 ZIF-8@ICG 納米復合顆粒的表征

使用濃度為10 mmol/L 的甲醇溶液作為緩沖液，分別配制ICG 溶液、ZIF-8 溶液、ZIF-8@ICG 溶液，使用紫外可見吸收光譜儀檢測樣品的吸光度，檢測波長范圍為400～900 nm。

1.2.3 光熱轉化性能測定

配制不同濃度的ZIF-8@ICG 溶液（0.05、0.1、0.2、0.5 和1 mg/ml）。取樣后經808 nm，1.5 W/cm2的近紅外光分別照射5 min。用紅外熱像儀記錄不同溶液的溫度隨時間變化的關系，并每隔30 s 拍攝對應圖片記錄不同樣品的升溫情況。

1.2.4 光熱循環穩定性測試

分別取ZIF-8@ICG 溶液和ICG 溶液接受808 nm，1.5 W/cm2的近紅外光照射5 min，每隔30s 用熱成像儀拍照，記錄對應的溫度變化。待樣品慢慢冷卻恢復室溫后再用相同功率激光照射5 min，每30 s 記錄一次溫度變化，共往復3 次升降溫循環。通過ZIF-8@ICG 與ICG 的熱循環穩定性的對比，來研究ZIF-8@ICG 和ICG 的光熱穩定性。

1.2.5 光熱殺菌性能測試

將PBS 緩沖液、ZIF-8 溶液、ICG 溶液、ZIF-8@ICG 溶液分別與1×106CFU/ml 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌懸浮菌液混合，每個菌種抗菌實驗各分為8 組：PBS 對照組、PBS 實驗組、ZIF-8 對照組、ZIF-8 實驗組、ICG 對照組、ICG 實驗組、ZIF-8@ICG 對照組、ZIF-8@ICG 實驗組。實驗組均接受808 nm，1.5 W/cm2的近紅外光照處理20 min，對照組無光照處理。隨后取樣涂布于LB 固體培養基中37 ℃恒溫培養12 h，分別記錄各組金黃色葡萄球菌/大腸桿菌的菌落數量，并比較實驗組樣品和對照組樣品的滅菌效果。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行數據分析。符合正態分布的計量數據以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間多重比較用LSD-t 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZIF-8@ICG 納米復合顆粒的表征

由圖1 可知，ZIF-8@ICG 納米復合顆粒在660～860 nm 之間有吸收，其中在782 nm 處有特征峰，與ICG 的吸收峰型（在780nm 處有特征峰）相似，同時因與此范圍內無特征性吸收峰的ZIF-8 負載稀釋了單位濃度的絕對含量，納米復合顆粒的吸收強度弱于相同濃度的ICG 對照組，上述數據均證明ICG已與ZIF-8 形成穩定的ZIF-8@ICG 納米負載結構。

圖1 ICG、ZIF-8@ICG 和ZIF-8 的紫外可見吸收光譜

2.2 ZIF-8@ICG 的光熱性能測試

ZIF-8@ICG 溶液（0.2 mg/ml）經過5min 的近紅外光照射（808nm，1.5 W/cm2）溫度可升高30.4℃，濃度升高至1 mg/ml 的溶液最高溫度可達到72.3℃，而對照組純水僅升高了2.4℃。同時拍攝的熱值圖亦顯示了相同的結果，ZIF-8 的包裹負載作用對ICG 結構將近紅外光能轉化為熱能的過程無不良影響，ZIF-8@ICG 整體結構具有良好的光熱轉化性能，見圖2A、2B。

圖2 ZIF-8@ICG 的光熱性能測試

2.3 ZIF-8@ICG 與ICG 光熱循環穩定性對比實驗

經過近紅外激光（5 min ，808 nm，1.5 W/cm2）第1 個照射周期后，ZIF-8@ICG 納米復合顆粒和未經負載的ICG 的溫度分別升至56.3 ℃和55.7 ℃。經第2 個激光照射周期后，未經負載的ICG 最高溫度僅為37.2℃，且還在持續減弱，說明其受自聚集和光熱降解等因素影響光熱轉化性能已大幅降低。與之相比，在經歷了第2、3、4 個激光照射周期后，ZIF-8@ICG 納米復合顆粒的最高溫度仍舊升高至50 ℃、47.1 ℃、43.6℃，表明ZIF-8@ICG 納米復合顆粒有效增強了光熱穩定性，改善了ICG 分子溶液中自聚集的問題，具有更加理想的實際應用價值，見圖3。

圖3 ZIF-8@ICG 與ICG 光熱循環穩定性對比實驗

2.4 ZIF-8@ICG 納米復合顆粒的光熱殺菌實驗

經近紅外光（808 nm，1.5 W/cm2）照射后，ZIF-8@ICG 納米復合顆粒對S.aureus和E.coli的殺菌率分別為99.97%和99.91%，優于未經負載的ICG對照組（80%和85%），差異有統計學意義（P＜0.001），見圖4～圖6。

圖5 ZIF-8@ICG 和ICG 光熱處理后金黃色葡萄球菌的存活菌落圖

圖6 ZIF-8@ICG 和ICG 光熱處理后大腸桿菌的存活菌落圖

3 討論

3.1 ZIF-8@ICG 納米復合顆粒的光熱性能及其循環穩定性研究

ICG 因其良好的組織滲透性、生物安全性及光熱轉換效率等特性[13，14]，是被美國藥物管理局（FDA）批準的應用于臨床研究的唯一一種近紅外光熱試劑[15]，在PTT 抗癌[16]、抗菌[17]等領域得到廣泛研究，然而ICG 穩定性較差且在人體內的半衰期短，嚴重影響其光熱治療效果，因此，通過提高ICG 穩定性以加強其光熱殺菌效果具有重要意義。本研究通過ZIF-8 中Zn2+與ICG 磺酸基的配位作用制備出ZIF-8@ICG 納米復合顆粒，并通過紫外可見吸收光譜表征驗證其負載結構的穩定性。通過光熱轉化實驗發現，在808 nm 近紅外光照射下，ZIF-8@ICG 溶液的升溫曲線與濃度呈正相關，且在1 mg/ml 濃度下最高溫度可達到72.3℃，ZIF-8@ICG 整體結構具有良好的光熱轉化性能，可用于進行細菌的光熱滅活。通過熱循環穩定性對比還發現，ZIF-8 的包覆作用顯著增強了ICG 的光熱穩定性，避免了溶液中ICG 分子自聚集現象，歷經4 次循環利用后仍產生20℃以上的升溫效果，保持了良好穩定的光熱轉化性能，具有更加理想的實際應用價值。

3.2 ZIF-8@ICG 納米復合顆粒的光熱殺菌性能研究

世界衛生組織（WHO）于2017 年提出亟須研發針對S.aureus和E.coli等具有高感染性和高致死率的多發耐藥菌的治療新方案[11]。與傳統抗生素療法相比，PTT 回避了耐藥性問題。作為PTT 的治療核心，光熱轉換劑能夠通過近紅外激光照射有效地將光能轉化為熱能，從而直接殺死病原體[12]。本研究通過光熱殺菌實驗發現，在近紅外光照射后，ZIF-8@ICG納米復合顆粒對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的殺菌率均接近100%，明顯優于未經負載的ICG 對照組。以上結果均證實ZIF-8@ICG 溶液吸收近紅外激光的能量后將光能轉化為熱能，升高的溶液溫度殺滅了金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，且滅菌效果顯著，達到了基于ZIF-8@ICG 納米顆粒光熱殺菌的目的。

3.3 總結與展望

利用ZIF-8@ICG 納米復合顆粒構建的新型光熱殺菌療法，操作簡便，可重復利用，光熱穩定性好，具有高效的光熱轉化性能，經近紅外激光照射后對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等常見菌感染展現出理想的光熱殺菌效果。由于PPT 療法物理特性的治療機制，在治療細菌感染（特別是耐藥菌感染）中具有極強的廣譜性并避免新的耐藥菌產生，ZIF-8@ICG 療法有望產生臨床轉化及應用價值。