苯二氮 類藥物檢測(cè)提取技術(shù)的研究進(jìn)展*

陳曉兵，李慧文，戴欣成，周 全，沙 鷗，吳赟帆，王滋文

（1.江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.連云港市第一人民醫(yī)院，江蘇 連云港 222061；3.江蘇海洋大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；）

在我國(guó)，每年約有480 萬(wàn)重癥醫(yī)學(xué)科（Intensive Care Unit，ICU）患者，其中接受鎮(zhèn)靜治療的患者占64%。為了幫助和改善患者睡眠、減輕和消除患者焦慮以及減輕患者器官應(yīng)激負(fù)荷，保護(hù)器官儲(chǔ)備功能，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，研究者們一直在尋找一種能快速起效、有效鎮(zhèn)靜、安全指數(shù)高且副作用小的理想鎮(zhèn)靜藥。苯二氮 類藥物（Benzodiazepines，BZDs）是目前ICU 應(yīng)用廣泛的鎮(zhèn)靜治療基本藥物，屬于第二代鎮(zhèn)靜催眠藥。該類藥物主要通過(guò)與腦內(nèi)苯二氮 受體結(jié)合，促進(jìn)γ 氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）與γ 氨基丁酸A 型受體結(jié)合，增加氯離子通道的開(kāi)放頻率，從而增強(qiáng)GABA 能神經(jīng)的抑制效應(yīng)，導(dǎo)致GABA 水平降低，去甲腎上腺素和多巴胺脫抑制性釋放，機(jī)體即產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用[1]。

自1961 年首個(gè)苯二氮 類藥物利眠寧誕生以來(lái)，已有近40 種結(jié)構(gòu)相近、藥理作用相似的該類藥物相繼應(yīng)用于臨床[2]，其中常見(jiàn)的主要有三唑侖（Triazolam）、地西泮（Diazepam）、咪達(dá)唑侖（Midazolam）、氯硝西泮（Clonazepam）、艾司唑侖（Estazdam）、瑞馬唑侖（Remimazolam）等。這些藥物的基本母核結(jié)構(gòu)為含氮的稠環(huán)1，4 苯并二氮雜 ，因結(jié)構(gòu)中都含有胺基，所以大多呈弱堿性，在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下易分解；另因具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，所以熔點(diǎn)、沸點(diǎn)較高且難揮發(fā)[3]。此類藥物大多在肝藥酶作用下代謝，代謝產(chǎn)物最終與葡萄糖醛酸結(jié)合而失活，經(jīng)過(guò)腎臟排出。多數(shù)藥物的代謝產(chǎn)物具有與母體藥物相似的活性，而其半衰期（t1/2）則比母體藥物更長(zhǎng)，因此在體內(nèi)易發(fā)生蓄積，產(chǎn)生不良反應(yīng)[4]。為了彌補(bǔ)此類藥物依賴肝腎代謝、易發(fā)生蓄積、半衰期延長(zhǎng)等不足，專家學(xué)者們研制出了依賴血漿酯酶代謝的一類鎮(zhèn)靜新藥—瑞馬唑侖，并廣泛應(yīng)用于臨床。由于BZDs 原料藥物經(jīng)體內(nèi)代謝的代謝程度不同，所產(chǎn)生的后遺效應(yīng)亦不同，因此對(duì)不同來(lái)源樣品中苯二氮 類原料藥物的分析監(jiān)測(cè)在藥物分析、食品安全及法醫(yī)學(xué)鑒定中具有重要意義。

目前常用的有關(guān)BZDs 原料藥的分析檢測(cè)手段有免疫測(cè)定法、色譜法、光譜法等，常用的樣品前處理方法有液-液萃取法、固相萃取法、固相微萃取法等。本文整理了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)不同來(lái)源樣品中苯二氮 類藥物的檢測(cè)手段和樣品前處理方法進(jìn)行了全面的分析，以期為研究機(jī)構(gòu)和科研人員提供相關(guān)信息，并為BZDs 的科學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 苯二氮 類藥物的檢測(cè)技術(shù)

1.1 免疫測(cè)定法

免疫測(cè)定法是指利用免疫學(xué)原理，以待測(cè)物作為抗原或抗體從而測(cè)定樣品中待測(cè)物質(zhì)含量的方法。免疫化學(xué)技術(shù)通常作為篩選試驗(yàn)，可確定微克級(jí)苯二氮 類藥物的存在。Rossi B 等[5]使用了兩種特異性較高的免疫測(cè)定法檢測(cè)了人體尿液中的部分苯二氮 類物質(zhì)，結(jié)果表明兩種方法檢測(cè)的物質(zhì)結(jié)果均為陽(yáng)性，是可靠的篩查方法。Huang W 等[6]用4 種免疫測(cè)定法檢測(cè)血中去甲安定、三唑侖、洛拉西泮和阿普唑侖，結(jié)果表明檢出限為3.0ng/ml，當(dāng)濃度等于和低于1.0ng/ml 時(shí)，靈敏度受到限制。

1.2 聯(lián)用技術(shù)

聯(lián)用技術(shù)是指將色譜法、質(zhì)譜法、光譜法等分析方法聯(lián)合使用，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度和精密度。

1.2.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gas Chromatographic-Mass Spectrometer，GC-MS）是將氣相色譜法與質(zhì)譜法結(jié)合，既彌補(bǔ)了GC 難以對(duì)復(fù)雜化合物中未知組分做出可靠的定性鑒定的缺點(diǎn)，又利用了鑒別能力很強(qiáng)且靈敏度極高的MS 作為檢測(cè)器，在環(huán)保、醫(yī)藥、農(nóng)藥和興奮劑等領(lǐng)域起著越來(lái)越重要的作用，是分離和檢測(cè)復(fù)雜化合物的最有力工具之一。

Papoutsis II 等[7]在pH 為9 的條件下，用氯仿對(duì)人體血漿樣品中地西泮等23 中常見(jiàn)的苯二氮 類藥物進(jìn)行液-液萃取，建立GC-MS 分析方法并進(jìn)行優(yōu)化，所有物質(zhì)的提取回收率均高于74.00%。Qriouet Z 等[8]通過(guò)固相萃取法對(duì)血漿樣品中的地西泮、阿普唑侖和氯硝西泮進(jìn)行萃取，采用GC-MS 進(jìn)行分析，該法測(cè)得地西泮、阿普唑侖和氯硝西泮的檢測(cè)限分別為0.09 μg/ml、0.20 μg/ml 和0.77 μg/ml。Drummer OH[9]采用簡(jiǎn)單的液-液萃取法，通過(guò)GC-MS/MS 分析檢測(cè)全血樣品中的10 種苯二氮 類藥物，測(cè)得10種該類藥物的檢測(cè)限和定量限分別在0.02～0.53 ng/ml 和1.0～2.0 ng/ml 范圍內(nèi)。Liu JL 等[10]用四氫呋喃和正己醇組成的超分子溶劑對(duì)尿液中的9 種苯二氮類藥物進(jìn)行分離富集，并采用GC-MS/MS 技術(shù)對(duì)該類藥物進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明GC-MS/MS 法測(cè)定的定量下限為0.2～5.0 ng/ml，提取回收率均大于81.12%。

1.2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）又叫液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動(dòng)相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開(kāi)，經(jīng)檢測(cè)器得到質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢(shì)的互補(bǔ)，將色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力，與MS 具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

葉璞等[11]利用固相萃取結(jié)合HPLC-MS/MS 提取分析了醫(yī)院污水處理系統(tǒng)中的17 種苯二氮 類物質(zhì)，結(jié)果表明該類物質(zhì)的排放均達(dá)標(biāo)。Martin D 等[12]從犯罪現(xiàn)場(chǎng)的物品中用一次性拭子提取了表面苯二氮 類藥物的殘留，采用液-液微萃取結(jié)合HPLCHRMS/MS 系統(tǒng)進(jìn)行定性和半定量分析，檢測(cè)限在1～14 pg/ml，提 取 回 收 率 在77%～107%。Garcia L等[13]采用LC-MS/MS 開(kāi)發(fā)了人體尿液和血漿樣品中苯二氮 類藥物的分析方法，并討論了基于免疫分析的篩查方法的可行性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所檢測(cè)的苯二氮 類藥物的檢測(cè)限均低于0.1 ng/ml。Mei V等[14]采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)于某死亡患者血液中的3-羥基苯那西泮、氯巴扎姆、氯硝唑侖等進(jìn)行分析，血液樣品體積為0.5ml，采用固相萃取技術(shù)對(duì)上述分析物進(jìn)行萃取分離，所得分析物的檢測(cè)限和定量限分別為0.5 ng/ml（信噪比＞3）和1 ng/ml，回收率在35%～90%。López-Rabu?al A 等[15]利用固相萃取技術(shù)與LC-MS/MS 聯(lián)用提取分析了胎糞樣品中的14 種苯二氮 類物質(zhì)，得到的檢測(cè)限為1～20 ng/g，提取回收率在35.9%～91.2%。

2 苯二氮 類藥物的提取技術(shù)進(jìn)展

由于苯二氮 類藥物吸收快、代謝迅速且半衰期短[16]，所以在生物體液內(nèi)的濃度很低，如唑侖類藥物在血漿中的最大治療濃度僅為0.02～0.25 μg/ml[17]，這就為實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)工作帶來(lái)了一些難度。因此，選擇合適樣品前處理方法，富集目標(biāo)物并去除雜質(zhì)很重要。目前所使用的提取方法有以下幾種。

2.1 液-液萃取

液- 液 萃 取 法（Liquid-liquid extraction，LLE）是利用物質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中的溶解度或分配系數(shù)的不同，使物質(zhì)從一種溶劑內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種溶劑中，經(jīng)過(guò)反復(fù)多次萃取，將待分析物提取出來(lái)。

Vogliardi S 等[18]以乙腈為萃取劑，采用低溫分配快速液-液萃取法提取分析了人體尿液中的地西泮、勞拉西泮等藥物，檢測(cè)限均低于5.0 μg/L，提取回收率在72.4%～100.4%，且線性良好。易小翠[19]考察了大鼠血漿和尿液中的氯硝西泮等藥物并優(yōu)化了萃取溶劑的類型、萃取時(shí)間、萃取次數(shù)等萃取條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在血漿樣品中加入5 倍體積的乙酸丁酯振蕩10 min 并提取一次得到的提取回收率較高，均大于90%；在尿液樣品中加入10 倍體積的乙酸乙酯振蕩10 min 并提取兩次得到的提取回收率較高，均大于80%。de Paula C 等[20]為了識(shí)別毒品犯罪，采用低溫分配液液萃取聯(lián)合紙噴霧質(zhì)譜法提取分析了飲料中的地西泮、氯硝西泮等物質(zhì)，結(jié)果表明檢測(cè)限為0.05 mg/L，提取回收率在90%～100%，在毒品犯罪領(lǐng)域有較好的研究前景。

2.2 固相萃取

固 相 萃 取 技 術(shù)（Solid Phase Extraction，SPE）是基于固-液相色譜理論發(fā)展而來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)，通過(guò)選擇性吸附和選擇性洗脫對(duì)樣品進(jìn)行富集分離凈化。由于固相萃取技術(shù)可提取微量待測(cè)物且避免液-液萃取的乳化現(xiàn)象，已成功應(yīng)用于苯二氮 類藥物的提取中。Stamper B 等[21]采用C18 柱快速提取人體尿液中的地西泮等21 中苯二氮 類藥物，過(guò)柱后用乙腈和甲醇按比例洗脫，并結(jié)合LC-MS/MS 進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為0.5ng/ml，平均回收率為91%。Anderson RA 等[22]對(duì)尸檢頭發(fā)樣本中的奧沙西泮等物質(zhì)利用ZSDAU 020 柱進(jìn)行提取，并用乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，檢測(cè)限均低于0.6 ng/mg。楊霄等[23]利用C18 和N-丙基乙二胺作為吸附劑對(duì)水產(chǎn)品中的6 種苯二氮 類藥物進(jìn)行提取凈化，并結(jié)合UPLC-MS進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為0.2～0.5 μg/kg，平均回收率為73.2%～110.6%。于峰等[24]同樣使用C18 和N-丙基乙二胺作為吸附劑對(duì)干血斑樣品中的奧沙西泮等物質(zhì)進(jìn)行富集純化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該固相萃取方法簡(jiǎn)單、快速且靈敏度高。

2.3 固相微萃取

固相微萃取技術(shù)（Solid-Phase Microextraction，SPME）是在固相萃取技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種萃取手段，因其操作簡(jiǎn)便、回收率高而被廣泛應(yīng)用。Abr?o LCC 等[25]以地西泮為模板，甲基丙烯酸為功能單體合成了分子印記聚合物，對(duì)血漿樣品中的苯二氮 類藥物直接進(jìn)行萃取，并用HPLC-DAD 進(jìn)行檢測(cè)，得到的檢測(cè)限為15 μg/L。Asgharinezhad AA等[26]合成了聚苯胺磁性納米復(fù)合物用于萃取人體血漿樣品中的勞拉西泮和硝西泮，并優(yōu)化了萃取條件，用HPLC-UV 進(jìn)行檢測(cè)，得到的檢測(cè)限分別為0.2～2.0 μg/L、0.5～1.8 μg/L，提取回收率分別為84%～99%、90%～99%。Jinno K 等[27]利 用SPME 聯(lián) 合 半 微 柱高效液相色譜法提取分析了人體尿液樣品中的地西泮等物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)證明該方法簡(jiǎn)便、快速、使用溶劑量少。

2.4 磁固相萃取

近年來(lái)，基于固相萃取技術(shù)發(fā)展而來(lái)的新技術(shù)—磁固相萃取技術(shù)（Micro-Solid Phase Extraction，MSPE）在食品、環(huán)境、醫(yī)藥等領(lǐng)域發(fā)揮著巨大的應(yīng)用潛力。MSPE 主要利用磁性或可磁化材料作為萃取劑對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行分離，通過(guò)外加磁鐵將吸附劑與樣品溶液分離。隨后通過(guò)合適的洗脫液對(duì)吸附在萃取劑上的待測(cè)物進(jìn)行洗脫，進(jìn)而進(jìn)入儀器檢測(cè)。MSPE 因其操作簡(jiǎn)便、萃取劑可重復(fù)使用、可避免基質(zhì)的干擾以及對(duì)痕量組分富集倍數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，在分離分析領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

Plastiras OE 等[28]通過(guò)合成磁性納米復(fù)合物（氧化石墨烯-磁性殼聚糖）選擇性萃取地表水樣中的阿替唑侖及氟硝西泮，然后使用HPLC-PDA 進(jìn)行檢測(cè)，得到的檢測(cè)限分別為3 ng/ml 及10 ng/ml，提取回收率在93.6%～112.9%，且線性良好。杜梨[29]以硅藻土（Dt）為固相支撐材料，用原位生長(zhǎng)法制備了ZIF-8@Dt-COOH 固相吸附萃取劑，結(jié)合高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)，建立了人體尿液中三種苯二氮類藥物（三唑侖、咪達(dá)唑侖和地西泮）的分析方法，得到的提取回收率在80.0%～98.7%。

3 總結(jié)與展望

苯二氮 類藥物種類繁多，具有催眠、鎮(zhèn)靜、抗驚厥等藥理作用，臨床應(yīng)用廣泛，因此亟待開(kāi)發(fā)更加靈敏、高通量、自動(dòng)化的提取分析手段。本文旨在對(duì)不同來(lái)源樣品中的苯二氮 類藥物的檢測(cè)方法和提取手段進(jìn)行綜述，為建立兼顧精準(zhǔn)度和推廣性的苯二氮 類藥物檢測(cè)的前處理和儀器檢測(cè)技術(shù)提供意見(jiàn)和發(fā)展方向。