響應面法優化萱草花總生物堿的提取工藝*

李盈，楊新惠，王琪

（1.石河子大學第一附屬醫院藥學部，新疆 石河子 832002；2.新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室/石河子大學藥學院，新疆 石河子 832002）

百合科萱草屬植物萱草（Hemerocallis fulvaL.），是民間傳統常用的中草藥，在我國各地栽培，根、莖、葉、花，均可入藥[1]。在民間傳統藥品使用中，萱草常用于醒腦安神、養血美顏、清熱解毒、通乳等[2]。近年來研究發現[3，4]，萱草具有抗腫瘤、抗菌、抗吸血蟲、鎮靜催眠、抗抑郁、護肝保肝等藥理作用。且萱草中生物堿成分豐富，藥理活性好[5]。另有研究表明，萱草中含有秋水仙堿等生物堿類成分，具有減輕炎性反應而起止痛作用的生物活性[6]。本研究分別運用加熱回流法和超聲輔助法提取總生物堿，在單因素的基礎上，采用響應面法對萱草花總生物堿的提取工藝進行優化，為該種植物的合理利用提供實驗理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

萱草干花2 kg，在新疆百草堂藥業集團購得。（R）-Jatropham （由本課題組前期實驗中，在此植物中所分離的化合物，因該單體化合物所得含量可以滿足此實驗需求，并且純度達到標準品所需，故選用該化合物為標準品），見圖1。

圖1 （R）-Jatropham 結構式

1.1.2 試劑

無水乙醇、二氯甲烷（天津市富宇精細化工有限公司）；濃鹽酸（四川西隴化工有限公司）；其余化學試劑均為國藥集團的分析純。

1.1.3 儀器

FW-100 型高速萬能粉碎機、DZKW-0-2 型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司）；V-2401PC 型紫外-可見分光光度計（日本島津）；N-1300 型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司，東京理化器械株獨資工廠）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorius BS110s 型萬分之一電子天平（北京賽多利斯天平有限公司制造）。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線繪制

參考文獻[7-10]，精確稱取本實驗室自提純（R）-Jatropham 標準對照品16.25 mg，用無水乙醇溶解定容至250 ml。精密吸取對照品溶液0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.20 ml 添加至10 ml 容量瓶里面進行定容處理。以0.90 ml 對照品溶液測最大吸收波長，無水乙醇為空白，于206 nm 波長處對吸光度A 進行測定，對照品溶液濃度C、吸光度值A 分別為橫坐標、縱坐標，以此完成標準曲線的繪制。得回歸方程為A=0.0879 C+0.0363，R2= 0.9993，線性范圍1.95～7.80 μg/ml。

1.2.2 萱草花總生物堿的提取工藝及提取量計算

萱草花經陰干粉碎后，過60 目篩。稱量萱草花粉末2.0 g，根據條件加入乙醇溶劑進行超聲，抽濾，濾液旋干，加入約20 ml 1% HCl 使其溶解，超聲1 min，加入2.0 mol/L NaOH 約4.0 ml，pH 值調到10～11，然后對其進行過濾處理，30 ml 二氯甲烷對濾液進行萃取，重復3 次，萃取液合并，旋干，浸膏用乙醇溶解，定容，即得萱草花總生物堿。按照繪制（R）-Jatropham 標準曲線的方法，測定萱草花總生物堿的吸光度A 值，根據式1 得出萱草花總生物堿的提取量。

式中：C、V、M 是萱草花總生物堿質量濃度（μg/ml）、萱草花總生物堿定容后體積（ml）用萱草花粉末質量（g）。

1.2.3 實驗設計

通過Box-Behnken 中心組合實驗設計不斷優化萱草花總生物堿提取工藝，以萱草花總生物堿提取含量為響應值，Design-Expert10 軟件進行實驗設計和數據分析，建立回歸模型。

2 結果

2.1 單因素實驗

本研究首先通過超聲時間、超聲溫度、乙醇濃度及物料比等因素進行分析，確定實驗因素與水平，然后進行響應面分析實驗設計。

2.1.1 不同超聲時間對萱草花總生物堿提取量的影響

精密稱量萱草花粉末5 份，每份1.0 g，分別加入75%乙醇，物料比1∶10（g/ml），溫度為40℃，采用“1.2.2”的方法提取萱草花總生物堿，對不同超聲時間（10、15、20、25、30 min）帶給萱草花總生物堿提取量相應影響情況加以評價。如圖2 所示，隨著超聲時間的逐漸增大，提取出的總生物堿含量先增加，在15 min 時出現最大值，后又減小，后又轉折增大，按照線性趨勢，后面時間有可能繼續增大超過15 min 的最大值，但是因時間因素以及儀器成本、損耗因素，超聲時間初步選為15 min。

圖2 超聲時間對萱草花中總生物堿提取量的影響

2.1.2 不同超聲溫度對萱草花總生物堿提取量的影響

精密稱量萱草花粉末5 份，每份1.0 g，分別加入75%乙醇，物料比1：10（g/ml），時間為25 min，采用“1.2.2”的方法提取萱草花總生物堿，評價不同超聲溫度（25、30、35、40、45℃）對萱草花總生物堿提取量的影響。如圖3 所示，超聲溫度慢慢升高，提取出總生物堿含量先增后減，超聲溫度達35℃，所提取總生物堿含量居于最高水平，主要與超聲溫度升高過程中，一些雜質析出影響了生物堿的提取[11]，因此超聲溫度設為35 ℃。

圖3 超聲溫度對萱草花中總生物堿提取量的影響

2.1.3 不同乙醇濃度對萱草花總生物堿提取量的影響

精密稱量萱草花粉末5 份，每份1.0 g，物料比1：10（g/ml），時間為25 min，溫度為40 ℃，采用“1.2.2”的方法提取萱草花總生物堿，對不同濃度溶劑（55%、65%、75%、85%、95%）帶給萱草花總生物堿提取量相應影響情況加以評價。如圖4 所示，乙醇濃度慢慢升高，萱草花總生物堿提取量不斷升高。乙醇濃度達75%，萱草花總生物堿提取量峰值也將出現。隨著乙醇濃度繼續增加總生物堿提取量下降，這可能是因為乙醇濃度繼續增加時一些揮發油或糖類等極性較低的物質被提取出來，從而影響了生物堿溶出，降低生堿的提取量[12]，因此選75%乙醇為提取溶劑的濃度。

圖4 乙醇濃度對萱草花中總生物堿提取量的影響

2.1.4 不同物料比對萱草花總生物堿提取量的影響

精密稱量萱草花粉末5 份，每份1.0 g，分別加入75%乙醇，時間為25 min，溫度為40 ℃，采用“1.2.2”的方法提取萱草花總生物堿，評價不同物料比（1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 g/ml）對萱草花總生物堿提取量的影響。如圖5 所示，隨著提取溶劑量的增加萱草花總生物堿的提取量隨之增加。固定乙醇濃度為75%，當料液比為1∶10 時，總生物堿提取量出現峰值。繼續增加料液比，總生物堿提取量開始下降。出現這種現象的原因可能是隨著溶劑體積的增大導致對萱草花的超聲不充分[13]，因此選1∶10（g/ml）為提取物料比。

圖5 物料比對萱草花中總生物堿提取量的影響

2.2 響應面法優化萱草花總生物堿提取結果

2.2.1 中心組合因素設計及結果分析

進一步結合單因素試驗結果顯示，選取乙醇濃度（A），超聲時間（B），物料比（C）和超聲溫度（D）為自變量，萱草花總生物堿提取含量（Y）為響應值，通過Design-Expert 10 軟件的Box-Behnken 完成響應面中心組合設計，對萱草花藥材總生物堿提取工藝加以優化。因素水平及編碼見表1，試驗設計方案及結果見表2，方差分析見表3。把表2 中數據通過Design-Expert 10 軟件完成多元模擬擬合分析，即可獲得以萱草花藥材中總生物堿提取量為目標函數二次回歸方程：Y=2.54+0.1A-0.041B+0.026C-（3.333E-003）D-0.075AB+0.017AC+0.027AD-0.033BC+0.065BD+0.017CD-0.58A2-0.082B2-0.12C2-0.12D2。表3 結果顯示，模型的擬合度值為P＜0.0001，證明模型擬合度極顯著，可以理想的擬合各因素對萱草花總生物堿提取量的影響結果，模型的失擬項為0.4670，P＞0.05，代表失擬項不顯著，說明此模型的實驗誤差相對較小。根據響應面結果可對相關因素對總生物堿提取含量帶來影響大小排序是：乙醇濃度（A）＞超聲時間（B）＞物料比（C）＞超聲溫度（D）。

表2 響應面設計方案與結果

表3 回歸方程方差分析

2.2.2 響應面分析

響應面法在對自變量最優值進行實際確定過程速度快、效率高的優勢較為突出，為得響應值最大化提供重要保障[14]。相關因素間兩兩交互也會影響萱草花中總生物堿提取含量結果，根據響應面圖與等高線圖將其直觀反映出來，曲面坡度與等高線形狀對交互作用強弱具有直接決定影響，曲面坡度陡峭，等高線呈橢圓形代表兩個因素交互作用極強，反之較弱。本實驗響應面圖和等高線圖見圖6～圖11。可知，隨著各因素的增加，總生物堿提取含量是呈先上升后下降的趨勢，當溶劑濃度為75%，提取時間為15 min，物料比為1∶10（g/ml），超聲溫度為35 ℃時達到最大值。圖6 響應面的坡度趨勢較陡，等高線為橢圓形，說明乙醇濃度與超聲時間交互作用較強，對萱草花總生物堿的提取有顯著影響，乙醇濃度曲線比提取時間曲線陡峭，說明乙醇濃度對總生物堿提取的影響大于超聲時間（A＞B）；圖7響應面斜率較陡，等高線為橢圓形，表示乙醇濃度與物料比的交互作用較強，對總生物堿提取量有顯著影響，乙醇濃度對生物堿提取量的影響曲線相對物料比的曲線趨勢較陡，表明乙醇濃度對生物堿提取量的影響較大（A＞C）；圖8 響應面斜率較陡，等高線呈橢圓形，說明乙醇濃度與超聲溫度的相互作用較強，對萱草花中總生物堿的提取量影響也較大。乙醇濃度的響應曲面比超聲溫度的曲面陡峭，說明乙醇濃度對總生物堿的提取量的影響比溫度的影響大（A＞D）；圖9 響應面的坡度較前面三個緩和，等高線較前三個偏圓，說明超聲時間與物料比也有交互作用，對提取物中總生物堿提取量也有影響，超聲時間的曲面相對于物料比趨勢較陡，說明超聲時間對提取物中總生物堿提取量的影響比物料比顯著（B＞C）；圖10 響應面坡度相對緩和，等高線呈圓形，由此能夠看出超聲時間和超聲溫度交互作用并不強，對給萱草花中總生物堿提取量的影響也十分有限，超聲時間相對于超聲溫度趨勢較陡，說明超聲時間對提取物中總生物堿提取量的影響比超聲溫度顯著（B＞D）；圖11 響應面的坡度較緩和，等高線近似圓形，說明物料比與超聲溫度交互作用很弱，對萱草花中總生物堿提取量影響較弱，物料比的曲面相對于提取溫度趨勢較陡，說明物料比對提取物中總生物堿提取量的影響比超聲溫度顯著（C＞D）。因此從響應面的陡峭程度可以看出，乙醇濃度對萱草花中總生物堿提取量的影響最顯著，其次是提取時間，接著是物料比，最后是超聲溫度（A＞B＞C＞D），與方差分析結果一致。

圖6 乙醇濃度與超聲時間對萱草花總生物堿提取含量的響應曲面及等高線圖

圖7 乙醇濃度與物料比對萱草花總生物堿提取含量的響應曲面及等高線圖

圖8 乙醇濃度與超聲溫度對萱草花總生物堿提取含量的響應曲面及等高線圖

圖9 超聲時間與物料比對萱草花總生物堿提取含量的響應曲面及等高線圖

圖10 超聲時間與超聲溫度對萱草花總生物堿提取含量的響應曲面及等高線圖

圖11 物料比與超聲溫度對萱草花總生物堿提取含量的響應曲面及等高線圖

2.2.3 驗證實驗

軟件Design-Expert10 分析計算最佳提取條件：超聲時間15 min，乙醇濃度75%，物料比1∶10（g/ml），超聲溫度35 ℃；選擇上述提取工藝，采用相同方法提取3 批樣品進行驗證，測定萱草花總生物堿提取含量為2.58 mg/g，驗證實驗結果表明，優選的提取工藝是穩定可控的。

3 總結

此實驗利用紫外-分光光度法完成萱草花總生物堿提取量測定方法的構建。首先采用單因素實驗篩選影響萱草花中總生物堿提取量的各種因素，在此基礎上，再利用中心組和響應面法試驗對其提取工藝進行了優化，進而所得總生物堿最佳提取工藝條件：超聲時間15 min、乙醇濃度75%、物料比1∶10（g/ml）、超聲溫度35℃；在此條件下，總生物堿提取量為2.58 mg/g，驗證實驗的結果與理論預測值相符較好。本研究確定了萱草花總生物堿的提取工藝，為進一步有效開發萱草及企業提取利用，提高效率奠定了實驗基礎。