煙草赤星病生防菌的鑒定及其抑菌機理

陳 娜,陳 婧,閔琪茹,安德榮,文俊明,楊 照,王 陽

(1.西北農林科技大學 植物保護學院,陜西楊凌 712100;2.陜西省煙草公司咸陽市公司,陜西咸陽 712000)

作為中國主要的稅收經濟作物之一,煙草的種植面積和卷煙的產量居世界首位[1]。煙草赤星病(Tobacco brown spot)是該作物上常見的病害之一,主要發生在煙草成熟的中后期,具有潛伏期短、爆發快的特點[2],病害嚴重時,病斑連接成片,煙葉干枯脫落,從而影響煙葉的產量和品質。近年來,煙草赤星病在中國各大煙區都有發生[3],成為煙草上除病毒病之外的第二大病害[4]。在實際生產過程中,煙草赤星病的防治措施主要包括抗病品種的培育、農業防治、化學防治和生物防治等[5],其中生物防治措施因其安全、高效、對環境友好等特性而逐漸成為煙草赤星病防治的研究熱點。

目前,國內外已經報道多種對煙草赤星病具有防治作用的生防菌株,主要包括生防細菌、生防放線菌和生防真菌等。錢發聰等[6]通過田間試驗表明,哈茨木霉(Trichodermaharzianum)LTR-2 可有效防治煙草赤星病,田間防治效果可達 53.5%,與多抗霉素相當;此外,其還具有增產保量作用。暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)LZ88 通過分泌的次生代謝產物和揮發性物質,能有效地抑制煙草赤星病菌菌絲的生長和孢子的萌發,誘導煙草抗性,經溫室試驗驗證,該菌株具有防治煙草赤星病的效果,能夠顯著降低煙草赤星病的發病率和病情指數[7]。但是,目前有關類芽孢桿菌防治煙草赤星病的報道較少,亟需篩選和開發對煙草赤星病具有防治作用的類芽孢桿菌。多粘類芽孢桿菌廣泛存在于土壤、根際和植物組織中,具有防治病害和促進植物生長的作用[8],且宿主范圍廣泛,一個菌株可以促進多種植物生長[9-12],具有巨大的生防潛力。本研究鑒定了一株對煙草赤星病病原菌具有拮抗作用的多粘類芽孢桿菌,并對其抑菌機理進行了初步探究,為煙草赤星病的防控提供新的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試生防菌 供試生防菌XNB-01分離自青海省西寧市采集的根際土壤樣品,并保存于西北農科技大學蔬菜病害及生物防治實驗室。

1.1.2 供試病原菌 煙草赤星菌(Alternariaalternata)、番茄早疫病菌(A.solani)、蘋果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、小麥莖基腐病菌(F.pseudograminearum)和梨腐爛病菌(Valsamali),由西北農科技大學蔬菜病害及生物防治實驗室分離并保存。

1.1.3 供試基礎培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(Potato Dextrose Agar,PDA)用于真菌的培養及保存。馬鈴薯葡萄糖液體培養基(Potato Dextrose Broth,PDB)用于鏈格孢的孢子萌發。1/2 酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(Yeast Extract Peptone Dextrose,1/2YEPD),用于鏈格孢菌絲體的培養。Luria-Bertani培養基(LB)用于XNB-01的培養及保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 生防菌的篩選及抑菌譜的測定 以煙草赤星病原菌為靶標菌,通過平板對峙法篩選對煙草赤星病菌具有拮抗作用的生防菌。分別將直徑為 6 mm的煙草赤星病原菌菌餅接種至 PDA 平板的中央,在距病原菌的左右兩側25 mm 處滴加 5 μL XNB-01菌液,28 ℃恒溫培養 7 d 后記錄抑菌半徑,每個處理重復 3 次。抑菌譜測定方法同上。

1.2.2 XNB-01形態學、生理生化及分子生物學鑒定 XNB-01的形態學和生理生化特性試驗參考《常見細菌系統鑒定手冊》[13]等書進行。包括其對碳源的利用、淀粉水解、纖維素降解、明膠液化、牛奶凝固與胨化、產硫化氫、接觸酶以及耐鹽性和溫度生長試驗等。

利用細菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根)提取培養48 h 的 XNB-01基因組總DNA,利用細菌 16S rDNA 通用引物進行 PCR 擴增,引物序列為:27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492R:5′-GGTTACCTTGTTACG-ACTT-3′[14]。PCR 產物用 1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海生工生物有限公司進行純化測序。測序結果拼接后提交至 NBCI 進行核酸同源性比對(BLAST),選取并下載相似性較高的序列,運用 MEGA7.0 軟件用 Neighbor-Joining 法構建系統發育樹。

1.2.3 XNB-01生防特性測定 參照文獻[15]對XNB-01的產蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶、幾丁質酶和鐵載體的能力進行測定。

1.2.4 XNB-01 對煙草幼苗的促生作用 促生試驗參考千慧敏等[16]的方法。取長勢一致的大十字期的煙草幼苗移栽至裝有滅菌基質的花盆中,一周后,將培養 72 h的XNB-01 配制成濃度為 1×109CFU/mL、1×108CFU/mL和1×107CFU/mL的菌懸液灌根,共灌根 2 次,每次間隔 7 d。3 次重復。第2次灌根7 d 后調查其根長、株高、地上部分和地下部分的干質量和鮮質量。

1.2.5 XNB-01 的防病作用測定 選取生長至 7～8 葉,長勢一致的煙草幼苗進行試驗。將培養 72 h的XNB-01 配制成濃度為 1×109CFU/mL和 1×108CFU/mL 的菌懸液,均勻的噴灑在葉片上,噴灑兩次,每隔1周1次。以清水為對照,噴灑 40% 菌核凈(禾益)為藥劑對照,每個處理重復3次。第2次噴灑 7 d 后接種病原菌,病原菌的接種采用注射法,注射煙草最下部葉片,每片葉片注射 5 處。7 d 后調查病情,計算病情指數和防病效果。

1.2.6 XNB-01胞內粗提物對鏈格孢的抑菌活性檢測 粗提物的制備:XNB-01接種在100 mL 的LB液體培養基中,30 ℃、180 r/min 恒溫振蕩培養 72 h,12 000 r/min離心5 min 后收集細胞,將細胞重懸在適量的無水乙醇中,28 ℃恒溫振蕩 2 h后12 000 r/min離心5 min取上清液, 50 ℃旋轉蒸發至干。粗提物用甲醇溶解,使其終濃度為50 mg/mL。

采用菌絲生長速率法[17]測定XNB-01胞內粗提物對鏈格孢菌絲生長的抑制效果,將粗提物配制成梯度溶液,與PDA混合后制成終濃度為200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL的含藥平板,對照加等體積甲醇。28 ℃ 培養5 d后用十字交叉法測量病原菌菌落直徑,計算EC50。試驗重復 3 次,抑制率計算公式如下:

菌絲生長抑制率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對照組菌落直徑×100%

以孢子萌發法[18]觀察XNB-01胞內粗提物對鏈格孢孢子萌發的影響,在1.5 mL 離心管中加入1 mL鏈格孢孢子懸浮液(1×106CFU/mL),再加入粗提物,使其終濃度分別為200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL,分別在4 h、6 h、8 h和10 h時測定萌發率。每個處理重復 3 次。于熒光顯微鏡下觀察200 μg/mL 藥劑處理 24 h 的菌絲形態;掃描電鏡下觀察 200 μg/mL 藥劑處理 6 h 的孢子形態,拍照記錄。

1.2.7 XNB-01粗提物對鏈格孢菌絲透性的研究 菌絲處理:將 1 mL 鏈格孢孢子懸浮液加入 150 mL 1/2 YEPD培養基中,28 ℃、160 r/min恒溫振蕩 2 d后抽濾收集菌絲體。菌絲體用 0.2 mol/L pH 7.0 的 PBS 沖洗 3 次后重懸于無菌水中,加入粗提物使其作用濃度分別為100 μg/mL和200 μg/mL,加入等體積量甲醇作對照。每個處理重復3次。

電導率的測定[19]:在處理第30 min、60 min、90 min、120 min、180 min、240 min 用電導率儀(CT-2,力辰科技)分別測定對照組和處理組的電導率。

核酸泄漏量的測定[19]:在處理2 h、4 h、6 h、8 h時過濾除去菌絲,收集上清液,紫外波長260 nm檢測其吸光度。

蛋白質泄漏量的測定[20]:在處理2 h、4 h、6 h、8 h時過濾除去菌絲,收集上清液,在280 nm下檢測其吸光度。

丙二醛(MDA)含量的測定[20]:處理24 h后過濾收集菌體,稱取0.5 g菌體,加PBS(0.1 mol/L pH 7.2)冰浴研磨,使用 MDA檢測試劑盒(南京建成)測定MDA含量。

1.3 數據分析

采用GraphPad Prism 8軟件作圖,利用 SPSS 26.0 軟件對試驗數據進行單因素方差分析,利用 Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌的篩選及鑒定

2.1.1 拮抗菌的篩選及抑菌譜的測定 菌株XNB-01對煙草赤星病菌拮抗效果明顯,抑菌帶寬達11.00 mm(圖1)。抑菌譜測定結果表明,菌株XNB-01對多種植物病原真菌有良好的拮抗效果(圖2),對其中的番茄早疫病菌、蘋果炭疽病菌、玉米大斑病菌、梨腐爛病菌4種植物病原菌的抑菌半徑超過10.0 mm。

圖1 XNB-01 對煙草赤星病菌的拮抗作用

圖2 XNB-01對7種植物病原真菌的抑制作用

2.1.2 XNB-01形態學鑒定 XNB-01在 LB 培養基上培養 48 h 后,菌落呈乳白色,不透明,有光澤、表面光滑、邊緣不整齊,具粘性,易挑取(圖3),沒有特殊氣味。革蘭氏染色呈陽性。掃描電鏡下觀察到,XNB-01菌體呈桿狀、橢圓形,長度為(2～3)μm×(0.2～0.4)μm(圖4)。

圖4 XNB-01的形態特征

2.1.3 XNB-01分子生物學與生理生化鑒定 對XNB-01的 16S rDNA片段進行擴增,經測序后獲得 1 452 bp序列片段,系統發育樹構建結果表明 XNB-01 與多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)ATCC 842 在同一分支上(圖5)。生理生化檢測結果顯示菌株XNB-01可利用葡萄糖、甘露醇、木糖、蔗糖、山梨醇等多種碳源;革蘭氏染色、酶凝、明膠液化、接觸酶、V-P測定等反應結果呈陽性;在4%的NaCl、pH 5～8的條件下生長狀況良好(表1)。

圖5 基于16S rDNA序列構建的系統發育樹

2.1.4 XNB-01 的生防特性分析 檢測結果表明,菌株XNB-01具有產 ACC 脫氨酶,產生蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶等多種細胞壁水解酶的能力(表2)。

表2 生防菌次生代謝產物

2.2 XNB-01 生防效果的測定

2.2.1 XNB-01 對煙草幼苗的促生作用 由表3可知, XNB-01在1×108CFU/mL 的濃度下對煙草幼苗的促生效果最佳,與對照相比接種菌懸液的煙草幼苗其株高、根的干質量和鮮質量、地上部分的干質量和鮮質量,分別提高30.60%、91.76%、59.75%、60.20%和74.23%。在1×109CFU/mL 的濃度下,抑制煙草幼苗的生長;施用濃度為1×107CFU/mL,煙草幼苗各項指標與對照組無顯著差異。

表3 XNB-01 對煙草幼苗的促生效果

2.2.2 XNB-01 對煙草赤星病的防治效果 盆栽試驗結果表明,對照煙草發病嚴重,病情指數為 84.44。煙草經XNB-01 處理后,病情指數顯著降低,1×109CFU/mL XNB-01的防效為 60.94%,與菌核凈的防效無顯著差異,1×108CFU/mL的防治效果為54.36%(表4)。

表4 XNB-01 對煙草赤星病的防治作用

2.3 XNB-01 胞內粗提物對A.alternata的抑菌機理

2.3.1 粗提物對A.alternata菌絲體的影響 如表5所示,與對照相比,粗提物對A.alternata菌絲生長具有明顯的抑制作用,且抑制效果與濃度呈正相關,其EC50值為 42.67 μg/mL,相關系數為 0.98。用 25 μg/mL、12.5 μg/mL粗提物處理時,其抑制率分別為 41.46%、23.54%,當其濃度達到 200 μg/mL時,抑菌率達到 76.59%。在顯微鏡下觀察到未經粗物體處理的菌絲平滑、較長,無分支,經粗提物處理后A.alternata菌絲與對照相比菌絲膨大,分支增多,形態發生改變(圖6)。

表5 粗提物對A.alternata菌絲生長的影響

A.對照;B.處理

2.3.2 粗提物對A.alternata孢子的影響 由圖7可知粗提物濃度為12.5～50 μg/mL 時,在 4 h有部分孢子萌發,但芽管的長度與對照相比長度較短,在6 h 時全部萌發,且芽管的長度隨時間逐漸變長。在 8 h 時高濃度處理的孢子也有少量的萌發。經粗提物處理后A.alternata孢子與對照相比形態發生了改變,失水皺縮干癟(圖8)。

A.對照;B.處理

2.3.3 粗提物對A.alternata細胞膜滲透性的影響 通過測定電導率發現,30 min內電導率呈上升趨勢,當粗提物使用量為200 μg/mL時,30 min之后的電導率變化量小,趨于穩定,電導率值在180 min達到最大,此時處理組的電導率為對照組的2.97倍,當粗提物使用濃度為100 μg/mL時,電導率在60 min 后趨于穩定(圖9-A),說明電導率的升高量和作用時間與粗提物濃度呈正相關。通過測定在260 nm處的吸光度發現,經粗提物處理后菌體核酸發生泄漏,在8 h時達到峰值,此時,處理組A260值分別為對照組的1.38和1.83倍(圖9-B)。蛋白質泄漏量在2 h內迅速升高,粗提物作用濃度為200 μg/mL時,在2 h時蛋白質泄漏量為對照組的8.28倍,在4 h時A280的值有所下降,低濃度藥劑處理6 h 時有所下降,在此之后,A280的值再次升高(圖9-C)。粗提物處理1 d后丙二醛含量變化如圖9-D。與對照相比XNB-01胞內粗提物在低濃度處理后,菌絲中丙二醛含量無明顯差異,高濃度的粗提物處理時,處理組與對照組菌絲丙二醛含量差異顯著,達對照的1.36倍。

A.電導率;B.核酸泄漏量;C.蛋白質泄漏量;D.丙二醛含量

3 討 論

近年由于連作和氣候因素的影響,煙草赤星病的發病率有所升高[21]。目前針對煙草赤星病最有效的防治方法是化學防治,但化學防治存在時效短、農藥殘留、污染環境等問題,所以開發安全高效的防治煙草赤星病的生防菌株成為目前研究熱點[22]。多粘類芽孢桿菌對多種植物病害具有防治效果,但有關防治煙草赤星病的研究較少。許多多粘類芽孢桿菌能夠通過多種途徑促進作物生長和發育。它們可以通過生物固氮來提供植物所需的氮源,同時還可以通過磷酸鹽溶解來提高土壤中的有效磷含量,還能夠產生植物激素吲哚-3-乙酸(IAA),并釋放鐵載體,從而直接促進作物的生長[23]。例如:P.polymyxaICAB01 是一株具有體外增磷特性的菌株,能夠在非生物脅迫條件下促進玉米幼苗的生長[24];Liu等[25]研究發現接種P.polymyxaYC0136后,煙草中相關植物激素基因的表達量(包括生長素、細胞分裂素和赤霉素等)增加。XNB-01在適宜的濃度下能夠顯著促進煙草幼苗的生長,但其具體促生機制有待進一步深入研究。除促進植物生長外,多粘類芽孢桿菌還具有防病作用。Liu等[26]研究發現在P.polymyxaSC2與辣椒的相互作用條件下,多粘菌素生物合成基因、趨化性和生物膜形成的相關基因在P.polymyxaSC2中被激活表達,從而增強其抑制病原菌的能力,此外,P.polymyxaSC2還能刺激辣椒中轉錄因子基因WRKY2和WRKY40的表達,使誘導辣椒的抗病性提高。本研究中,當XNB-01的噴施濃度為1×109CFU/mL時,對煙草赤星病的防治效果與菌核凈相當,可能與XNB-01誘導煙草產生系統抗性有關。

在多粘類芽孢桿菌抑菌機理的研究中,其中一種作用機制是多酮類化合物和非核糖體肽(NRPs)等抗菌化合物的分泌[27]。P.polymyxaE681通過產生多種抗生素合成酶,包括編碼非核糖體肽的多粘菌素、鐮刀菌素等,可以有效保護植物免受真菌、卵菌和細菌等病原微生物的侵害,基因組測序結果表明,在P.polymyxaE681的基因組序列中,至少存在6個與抗生素合成相關的基因簇,這些基因簇的存在使得P.polymyxaE681具有強大的抗病能力[12]。Li等[28]研究發現P.polymyxaWLY78 對黃瓜枯萎病菌具有抑制作用,其產生的殺鐮孢菌素能夠抑制尖孢鐮刀菌的孢子萌發,使菌絲破裂成碎片,經殺鐮孢菌素處理的病原菌的離子、核酸、蛋白質、可溶性糖等物質泄漏。除非核糖體脂肽類抗生素以外的化合物對病原菌也具有拮抗作用,例如P.polymyxaA26的生物膜孢外多糖能夠拮抗禾谷鐮刀菌[29]。本研究證明,經粗提物處理后A.alternata菌絲體和孢子的生長受到抑制,菌絲體細胞膜的通透性發生改變,使細胞內的電解質、核酸等物質發生泄漏,菌體內丙二醛的含量升高,造成膜脂過氧化,細胞膜氧化損傷,最終導致細胞的死亡。本研究雖對 XNB-01 的生防能力和抑菌機理進行了初步研究,但發揮拮抗作用的物質,生防菌的基因組學以及生防菌與煙草、病原微生物之間的相互作用機理尚不明確,還需完善。

4 結 論

本研究鑒定了一株對煙草赤星病病原菌具有抑制效果的多粘類芽孢桿菌(P.polymyxaXNB-01),其胞內粗提物不僅能夠抑制A.alternata菌絲的生長和孢子的萌發,還能改變細胞膜的通透性;盆栽促生和防病效果明顯,展現出良好的生防應用潛力。