分枝(瓜)列當寄生煙草過程中轉移miRNA篩選及其功能預測

孫 暢,姚兆群,劉倩倩,卞鵬軒,張學坤,趙思峰

(新疆綠洲農業病蟲害治理與植保資源利用自治區高校重點實驗室/石河子大學 農學院 832003)

microRNAs(miRNAs)是一類內源性長度約為18～24 nt的非編碼單鏈RNA分子,已有大量文獻表明其在植物生長發育、激素信號轉導及脅迫響應等方面都發揮著重要調控作用,甚至可以跨界調控其他物種基因的表達[1-4]。Zhang等[5]研究發現棉花miR159和miR166在感染黃萎病菌后轉移至大麗輪枝菌(V.dahliaeKleb)中,通過結合和沉默與毒力相關的蛋白HIC-15(異毛菌素C-15羥化酶)和CLP-1(Ca2+半胱氨酸蛋白酶)增強棉花對大麗輪枝菌的抗性。Wang等[6]研究表明小麥條銹病菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)Pst-milR1在侵染時轉移至宿主體內,通過結合Pr2參與跨域RNA干擾從而降低宿主抗性。寄生性植物及其寄主之間通過吸器連接也存在miRNAs的交流,菟絲子(Cuscuta)作為全寄生性寄生植物,因其寄主范圍廣泛,其與寄主之間的miRNAs交流研究較多,菟絲子與擬南芥、煙草、番茄等寄主之間均發現存在miRNAs的相互轉移[7]。Shahid等[8]報道菟絲子miRNA能通過吸器轉移到與其聯接的寄主莖上并干擾寄主miRNA和phasiRNA表達。采用RNAi技術干擾分枝列當與乙烯合成路徑相關基因PaACS、控制寄主向寄生物養分傳遞的基因Pam6PR和列當感受早期侵染信號的基因PaPrx1基因沉默后,分枝列當(PhelipancheaegyptiacaPers.)在番茄和煙草上形成的瘤節數量和生物量顯著降低[9],說明分枝列當與寄主之間也存在RNAs轉移并可通過RNAi技術防治分枝列當。分枝列當可侵染甜瓜、西瓜、番茄、煙草等重要經濟作物。目前防治列當的主要方法有加強檢疫、人工拔除、選育抗病品種等措施,因其具有種子庫龐大、種子微小及種子休眠時間長等特點,導致感染列當地塊根除不凈,連年噴施農藥易使列當產生抗藥性,生物防治很難在當年對列當產生效果,列當易突變產生新小種使寄主原本的抗性品種抗性喪失等,防控難度極大[10]。RNAi技術能夠同時針對多個靶基因,有效防止單一位點突變導致的抗病抗性喪失,是十分有前景的抗病育種手段。在分枝列當寄生寄主時,是否與寄主存在miRNA相互交流及轉移miRNA的功能相關研究報道較少。煙草是常用的模式植物之一,其基因組庫已基本構建完全,也是瓜列當的高感寄主之一,本研究以分枝列當-普通煙(NicotianatabacumLinn.)作為研究體系,分別對寄生有分枝列當的煙草根部、寄生接觸點和列當莖稈取樣進行sRNA測序分析,以期明確分枝列當在寄生煙草過程中是否存在miRNA轉移,同時篩選出轉移的miRNA并對其功能進行預測,為揭示miRNA在列當-寄主間互作中機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

煙草種子為寄生植物防控研究室自留種;分枝列當植株及種子采集于新疆生產建設兵團塔城市163團4連,經形態學和分子生物學鑒為分枝(瓜)列當(P.aegyptiacaPers.)。

1.2 方法

1.2.1 樣品準備 將煙草種子均勻播撒在被水浸透的蛭石和營養土(體積比1∶1)基質中,置于溫室中培養(溫度28 ℃,光照度為10 000 lx,光照時長16 h/d,黑暗8 h/d),待煙草幼苗長出一片真葉時移栽至拌入完全成熟的分枝列當種子0.02 g混有蛭石和沙子(體積比1∶1)基質的花盆(口徑:16 cm,高度:12.5 cm)中,每盆一棵,用水浸透,10次重復,以10盆未拌分枝列當種子處理作為對照。將播種好的各處理盆栽隨機擺放,置于溫室中培養(溫度28 ℃,光照度為10 000 lx,光照時長16 h/d,黑暗8h/d),正常澆水管理。

1.2.2 sRNA測序 利用Small RNA Sample Pre Kit試劑盒(武漢錦奧生物科技有限公司)構建文庫,通過Qubit 2.0進行初步定量分析,將構建的文庫稀釋至1 ng/μL,再利用高靈敏Agilent 2100對文庫的insert size進行檢測,質檢后使用qRT-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度>2 nmol/L),以保證文庫質量,庫檢合格后,把不同文庫按照有效濃度>2 nmol/L及目標下機數據量的需求集中后進Illumina SE50測序。

1.2.3 數據處理 使用Illumina Casava 1.8檢查數據錯誤率,堿基位置的測序錯誤率低于 0.5%視為合格。利用Cutadapt 1.9.1(https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.html)去除原始數據中含polyA/T/G/C、質量值sQ≤20、未知堿基N的比例大于10%的低質量reads及接頭(5′端接頭5′-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC-3′;3′端接頭5′-AGATACGGAAGAGCACACGTCT-3′)序列,并對過濾后的clean reads進行18～22 nt的長度篩選。采用bowtie 1.3.0(http://bowtie-bio.sourceforge.net/manual.shtml)將長度篩選后的miRNA定位到煙草基因組數據庫(Nitabv1.0 Chr Edwards 2017)中進行比對,獲取已知miRNA的二級結構,各樣本中miRNA的序列、長度及表達量等信息。利用mirDeep2 2.0.0.2(https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2.git mirdeep2.0.0.2)根據前體序列預測新miRNA并獲取其二級結構等信息。

1.2.4 轉移miRNA篩選 將寄生煙草根(NR)、寄生部位(NC)、列當莖稈(NP)及未寄生煙草根(NK)樣品的測序基因信息在煙草基因組(Nitabv1.0 Chr Edwards 2017)中比對,從中篩選表達量>10的miRNA,利用bowtie2 2.3.4.1(http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml)將其映射至列當基因組(本課題組前期測序,未發表)中,從中篩選unmapping的miRNA,即煙草轉移至列當的miRNA。同時將寄生煙草根(NR)、寄生部位(NC)及列當莖稈(NP)樣品測序基因在列當基因組中比對,從中篩選表達量>10的miRNA,利用bowtie2將其映射至煙草基因組(Nitabv1.0 Chr Edwards 2017)中,從中篩選unmapping的miRNA,即煙草轉移至列當的miRNA。

1.2.5 qRT-PCR驗證 樣品總RNA經 DNase I處理后,利用RransScript Green miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix 試劑盒(全式金公司)合成cDNA,20 μL反應體系:Total RNA(75 ng/μL)2 μL;TransScript miRNA RT Enzyme Mix 1 μL;2×TS miRNA Reaction Mix 10 μL;RNase-free Water 7 μL。反應條件:37 ℃孵育 1 h,85 ℃處理5 s。隨機選取差異miRNA,通過Primer 5.5.0(http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/)軟件設計引物,引物詳情(表1),通過ABI Prism7500定量PCR儀進行qRT-PCR,20 μL反應體系:cDNA 2 μL;2×PerfectStartTM Green qPCR SuperMix 10 μL;特異性上游引物(10μmol/L)0.4 μL;Universal miRNA qPCR Primer(10 μmol/L)0.4 μL;Passive Reference Dye(50×)0.4 μL;Nuclease-free Water 6.8 μL。反應條件:94 ℃預變性30 s;94 ℃擴增5 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸10 s,40個循環;95 ℃變性15 s,55 ℃復性15 s。以U6(LOC 103502534)基因為內參[11],每個樣品3個重復,采用2-△△Ct法[12]計算各樣品中目標miRNA的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物信息

2 結果與分析

2.1 sRNA測序結果與分析

經Illumina SE50平臺測序共構建12個煙草sRNA文庫,獲得151 216 698條raw reads,經質控后共獲得了148 353 885條的clean reads,各樣本的Q20>99%,Q30>96%,鳥嘌呤和胞嘧啶(GC)含量范圍為49.63%～54.07%,測序錯誤率占比0.01%,低質量讀數平均占比0.18%。長度篩選后各文庫sRNA數量占比77.12%,平均序列長度為22 nt(圖1)。對sRNA進行信息注釋共獲得495 255條已知miRNA和13 370條新miRNA,總miRNA的占比8.2%,仍有22.01%的sRNA在煙草基因組中未注釋,表明有很多sRNA有待挖掘(表2)。

圖1 樣品sRNA長度分布頻率

表2 sRNA注釋數量統計及占比結果

2.2 miRNA注釋分析

為了明確測得的miRNA的具體功能,對miRNA進行注釋分析,注釋長度結果顯示,12個文庫中已知miRNA數量均高于新miRNA(圖2-A),有待研究注釋的miRNA仍有很多。本研究共注釋到312個miRNA,這些miRNA隸屬于20個miRNA家族,內部成員包含1～5個不等,其中以MIR159和MIR6025家族成員最多(圖2-C),MIR159家族主要與花粉發育有關[13],且能夠在植物體內負調控免疫防御反應[14],MIR6025則是茄科植物特有的一類miRNA[15],這種特有miRNA被認為是一種特異型的抗病進化特征[16]。同時對miRNA二級結構和miRNA的堿基偏好性進行預測和分析,miRNA前體具有莖環二級結構、其3′端有2 nt的懸垂(圖2-B),且堿基1位對U有強偏好,10位對A有較強偏好(圖2-D),符合miRNA的堿基偏好性規律,表明測序得到的miRNA質量及可信度較高,可用于后續試驗的分析。

A.不同樣品已知及新miRNA數量;B.miRNA二級結構示意圖,整個序列是miRNA前體,紅色突出部分為成熟體序列;C.樣品中miRNA家族成員及其成員數;D.miRNA堿基偏好性示意圖

2.3 差異miRNA及靶基因富集分析

植物在遭受生物脅迫時會啟動自身的免疫防御系統,通過對病程相關蛋白(pathogenesis-related protein,PR蛋白)、和抗病相關基因(resistance gene,R基因)的調控阻止有害生物帶來的負面影響[17]。通過高通量測序篩選生物脅迫中產生的差異基因,并對其靶基因進行注釋和分析,可以快速預測差異基因的生物學功能,從而進一步了解植物的抗生物脅迫的分子過程。對NR和NK的miRNA差異表達分析結果表明,與NK相比,NR共產生了49個差異miRNA,包括17個已知miRNA和32個新預測的miRNA,30個基因顯著下調表達,靶mRNA主要參與植物根系的生長和水楊酸的合成;19個基因顯著上調表達(圖3),靶mRNA主要參與礦質元素吸收和積累及脫落酸(ABA)的表達相關。表明寄主可能通過這些差異miRNA介導寄主產生防御相關激素和限制營養物質供給抵御列當寄生。

橫坐標表示煙草被瓜列當寄生后的miRNA表達倍數變化(log2 fold change,P<0.05);縱坐標表示表達差異的顯著性水平(lg P-value,P<0.05)

為了明確差異基因的調控機制,對列當-煙草寄生系統中的差異基因的靶基因進行GO富集,結果顯示這些靶基因參與了2 697個生物學功能條目,包括343個細胞組分條目、1 579個生物學過程條目和775個分子功能條目,其中有1個生物學過程條目—蛋氨酸代謝過程(methionine metabolic process)和包括有機環化合物結合(orgamic cyclic compound binding)、雜環化合物結合(hetero cyclic compound binding)、離子結合(ion binding)、小分子結合(small molecule binding)和碳水化合物衍生物結合(carbohydrate derivative binding)在內的18個分子功能條目顯著富集,其中有機環化合物結合和雜環化合物結合條目富集靶基因最多,高達655個靶基因(圖4),表明煙草在被分枝列當寄生后可能通過分子功能中相關化合物基因的表達啟動植物免疫反應調控通路。

1.蛋氨酸代謝;2.甘氨酸結合;3.陰離子結合;4.碳水化合物衍生物結合;5.腺苷酸核氨酸結合;6.腺苷酸結合;7.嘌呤核苷結合; 8.核糖核苷結合;9.嘌呤核糖核苷結合;10.ATP結合;11.核苷磷酸結合;12.小分子結合;13.離子結合;14.嘌呤核糖核苷三磷酸結合;15.5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸-半胱氨酸 S-甲基轉移酶;16.5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸-L-谷氨酸-伴甲基轉移酶;17.有機環化合物結合;18.雜環化合物結合

為了進一步明確差異基因的功能,對差異基因的靶基因進行KEGG富集,相關靶基因在硒化合物代謝(selenocompound metabolism)、托烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成(tropane, piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis)、硫代葡萄糖苷的生物合成(glucosinolate biosynthesis)、半胱氨酸和蛋氨酸代謝(cysteine and methionine metabolism)、丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)、肌醇磷酸代謝(inositol phosphate metabolism)和氰基氨基酸代謝(cyanoamino acid metabolism)通路中顯著富集(圖5)。

橫坐標代表差異基因中與該Term相關的基因數與整個差異基因總數的比值,縱坐標為KEGG注釋通路,圓點大小代表該通路基因數量,P-value≤0.05

硒作為植物生長發育時重要的微量元素之一,低濃度(<8.0 mg/kg)時能夠提高植物體內活性氧防御反應,高濃度硒(>16 mg/kg)則會抑制活性氧防御反應,導致SOD酶與POD酶含量下降[18]。而硫代葡萄糖苷的生成不僅可以影響植物體內包括吲哚乙酸(IAA)在內的多種生長素的變化[19],還被證明參與了植物抗病反應[20]。另外,植物在被病原物入侵時,其細胞呼吸也會受到病原物的刺激并通過合成丙酮酸脫羧酶(PDC),將丙酮酸轉化為乙醛和CO2從而產生能量用來抵御病原物的入侵[21]。這些證據表明這些差異表達miRNA在煙草抵御列當入侵中發揮重要作用。

2.4 轉移miRNA的篩選結果

通過對轉移miRNA的篩選,鑒定到3個從煙草轉移至列當的miRNA和2個從列當轉移至煙草的已知miRNA。其中3個從煙草轉移至列當的miRNA分別為nta-miR319a、nta-miR398和novel_6,靶基因功能主要參與植物細胞有絲分裂、植物抗逆和過敏反應(HR);2個從列當轉移至煙草的miRNA分別為sly-miR396a-5p和sly-miR396b,靶基因功能主要參與涉及水楊酸(SA)的產生和植物根系生長有關。從這些預測到的轉移miRNA的功能推測,由煙草轉移至分枝列當的miRNA可能通過植物過敏性壞死反應和限制寄主根系生長來抑制列當的寄生,而分枝列當轉移至煙草的miRNA則可能通過調節植物激素來擾亂煙草免疫防御反應。由于miRNA調控機制復雜,因此本研究篩選到的轉移miRNA的主要靶基因信息見表3。

表3 轉移miRNA及靶基因注釋信息

2.5 差異基因及轉移miRNA的qRT-PCR驗證

選取了12個差異基因及轉移miRNA對其相對表達量進行qRT-PCR驗證,結果顯示所選取的基因的qRT-PCR結果與sRNA測序含量盡管存在差異,但其在各樣品中的表達趨勢具有一致性(圖6),說明sRNA測序結果可靠,轉移miRNA的篩選結果可信。

圖6 差異miRNA相對表達量qRT-PCR驗證

3 討 論

已有大量文獻證實寄主和寄生物之間存在復雜的物質轉移。Jiang等[22]研究表明菟絲子通過從過表達磷脂酶乙酰轉移酶(PAT)基因的轉基因宿主獲得對草甘膦的瞬時抗性,而大豆蚜蟲(Aphisglycines)取食寄生大豆的菟絲子后誘導了寄主大豆的系統防御反應,從而增強了大豆植株對斜紋夜蛾(Spodopteralitura)和大豆蚜蟲抗性[23]。Zhang等[24]研究發現N系統信號可以通過菟絲子在缺N植株和N充足植株間雙向轉運,從而導致N充足植株對N的吸收增加,這些N系統信號還誘導了油菜和寄主之間的許多遠距離移動的mRNA轉移。列當作為寄生在寄主根部的全寄生性植物,同樣存在著大量轉移物質,Kado等[25]研究檢測了列當科的5種寄生植物,在Orobancheminor和Aeginetiaindica中共檢測到106個水平基因轉移(HGT),HGT基因分別約占編碼基因的0.1%和0.2%。Aly等[26]研究發現,當表達GFP的轉基因番茄植株被分枝列當寄生時,大量的GFP從寄主韌皮部轉移到列當韌皮部,并在列當根瘤和莖稈中積累。另外黃瓜花葉病毒(CMV)、番茄花葉病毒(ToMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)和黃曲葉病毒(TYLCV)也被證明可從受侵染的寄主植物轉移到分枝列當上[27]。這些證據表明在寄生植物和寄主間雙向交流的大分子物質在其寄生體系中具有重要作用,但目前對列當與寄主間其他物質轉移仍有待研究。

miRNA可以通過宿主轉移至寄生性生物體內,通過RNA干擾(RNAi)提高寄主對寄生生物的抗性[5]。Shahid等[8]研究表明菟絲子在寄生擬南芥和本氏煙時積累了大量新的miRNA,這些miRNAs作為寄主基因表達的跨物種調節因子,在寄生過程中可能發揮毒力因子的作用。但分枝列當在寄生普通煙的過程中是否以miRNA復合體進行長距離移動尚有待研究[28]。本研究通過對煙草與列當的基因組數據庫的篩選,篩選出了3個從煙草轉移至列當的miRNA和2個從列當轉移至煙草的已知miRNA。其中MiR319a能夠通過抑制TCP(Teosinte Branch 1/CycloidEA/PCF)家族基因的表達來控制植物葉片細胞分裂停滯[29],在被菌核病侵染時,油菜體內的miR319含量顯著上升,并參與影響植物對菌核病菌引起的莖腐病的抗性[30]。在被列當寄生時,miR319的含量同樣顯著升高,推測miR319不僅在煙草體內參與了植物抗病反應,且通過轉移至列當體內,影響列當細胞的有絲分裂,使其擴展受阻,抑制其生長。而miR398a主要參與活性氧清除酶Cu/Zn超氧化物歧化酶基因的負調控,寄生體毒性與致病力越強,miR398a上調幅度越大,最終導致被寄生處宿主的細胞因ROS過多而死亡[31],煙草在被列當寄生后導致根部miR398a的顯著表達,這與Fujibayashi等[31]的研究結果一致,miR698a或通過抑制寄生根部細胞ROS酶的活性,增加了寄生部位細胞ROS含量,最終導致被寄生細胞因死亡限制列當的寄生,miR398a的轉移也能夠通過使列當細胞的壞死來限制列當的生長。

有些miRNAs作為寄主基因表達的跨物種調節因子,在寄生過程中能夠發揮毒力因子的作用[32]。有研究表明轉基因番茄中miR396a-5p和miR396a-3p的增加增強了番茄對致病疫霉(Phytophthorainfestans)和灰霉菌(Botrytiscinerea)的敏感性,并且抑制了植物體內水楊酸(SA)和茉莉酸的產生(JA)[6, 8]。列當sly-miR396a-5p的轉移,與煙草水楊酸生成相關基因的顯著下調或存在潛在關聯;miR396b則主要通過靶向生長調節因子(GRF)基因來調控植物的生長發育[33],因此推測分枝列當可能通過轉移miRNA減弱煙草的免疫防御相關反應、調節煙草根部生長來提高自身發育、增強自身侵染力。

4 結 論

瓜列當在寄生煙草時存在miRNA相互轉移的現象,轉移miRNA靶基因注釋結果表明,煙草作為寄主可能通過miRNA的轉移來抑制或限制列當的寄生,列當作為全寄生植物也可能會利用miRNA的轉移來抑制寄主防御反應的信號應答。