范鈺琪,任嘉豪

(1.西北大學 化學與材料科學學院,西安 710127;2.東北大學 材料科學與工程學院,沈陽 110819)

隨著養殖業的發展,中國每年產生畜禽糞便急劇增加,其中豬糞占比高達32.28%[1]。當畜禽糞便排放量超過其土地承載量,便會造成污染[2]。如何無害化處理這些有機廢棄物并對其進行資源化利用,已成為全世界關注的問題[3]。好氧堆肥作為一種低廉有效的處理技術,能夠有效地將有機物轉化為穩定、安全衛生的肥料產品[4-5]。然而,傳統堆肥受限于微環境調節不足,常會造成堆肥產品腐殖化率較低、發酵不徹底,甚至會對植物根系發育和種子發芽率造成負面影響[4]。為了解決這些問題,Wang等[6]研究指出,在豬糞堆肥物料中添加鈣基膨潤土,能有效調節堆肥微環境、促進堆肥物料腐殖化過程,并能顯著增加小白菜生物量和葉綠素含量。也有研究表明,接種枯草芽孢桿菌能顯著減少廚余垃圾堆肥過程溫室氣體排放,并提高產品的品質[7]。為促進有機廢物的高效無害化處理和資源化利用,仍需加強合適添加材料的篩選研究[6]。

納米零價鐵(NZVI)因其理化特性優良和環境友好等特點被廣泛應用于農業和環境領域。NZVI不但能為微生物提供鐵微量元素補充[8],還可有效去除污水中的有害污染物[9],甚至還能促進污泥等有機廢物的水解酸化和發酵過程[10]。也有研究發現,在好氧堆肥體系內添加NZVI,可以促進抗生素降解并改善細菌群落結構[11]。但近年來,關于堆肥添加NZVI的研究主要集中在重金屬、抗生素方面[11-12],而對于堆肥過程中腐殖化進程和氣體排放鮮有報道。探究添加NZVI對堆肥過程有機物料碳轉化過程的影響,可以了解其對堆肥腐殖化進程和氣體排放的影響,并由此來判定NZVI在堆肥體系內的適用性。因此,本研究設計不同比例的NZVI與豬糞聯合堆肥,測定堆肥過程中的腐殖化指標及微生物群落變化,并分析堆肥過程中碳轉化和微生物群落之間的關系,旨在為評估NZVI添加劑在有機物料堆肥處理中的作用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

新鮮豬糞采自西北農林科技大學農作三站養殖場,枸杞枝條采自寧夏回族自治區某農場,其基本理化性質如表1所示。NZVI購買于浙江亞美納米科技有限公司(純度99.99%)。

表1 堆肥原料理化性質

堆肥共設置4個處理,新鮮豬糞和枸杞枝條以干基質量5∶1充分混合后裝入100 L的好氧堆肥發酵罐內,以不添加任何添加劑作為對照,添加干基質量比例分別為2.5%、5%和7.5%的NZVI,進行為期50 d的好氧堆肥,試驗處理分別記為T1、T2、T3和T4。堆肥前所有處理C/N比均調節至30左右,同時調節堆體含水率至60%左右,在嗜熱和腐熟期分別用鼓風機以約400和800 mL/(kg·min)的恒定氣流速率對堆肥裝置通風5 min,間隔1 h,整個堆肥過程中利用去離子水保證堆體含水率始終維持在60%左右。在堆肥14、21和35 d,進行人工翻堆,整個堆肥試驗過程沒有滲濾液溢出。

1.2 樣品采集

分別在1、3、7、14、21、28、35、42和50 d采集樣品。每次采集樣品前均記錄物料的質量,均勻混合后,采集約500 g樣品并隨機分成兩部分:一份儲存在-30 ℃冰箱中,另一份風干并過篩,用于物料理化性質測定。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 堆肥過程碳養分測定 有機質(OM)含量通過灼燒失重分析,使用馬弗爐在550 ℃下灼燒4 h,測穩定物質質量;總有機碳(TOC)和水溶性有機碳(DOC)使用TOC分析儀(島津,日本)測量;CO2和CH4排放量采用靜態箱法通過真空袋收集,并在前14 d每天測量,此后每2 d測量1次,然后使用氣相色譜儀(7890B,Agilent,USA)檢測CO2和CH4的濃度。胡敏酸(HA)、富里酸(FA)和胡敏素(Humin)按照國際腐殖質協會提取方法測定,分別用NaP2O7·10H2O溶液在室溫下浸提24 h,樣品浸提劑比為1∶10(W/V)然后以10 000 r/min離心20 min,將上清液與殘留物分離,并通過0.45 μm濾膜過濾,通過使用5.0 mol/L HCl(25 ℃,pH 1.5,24 h)沉淀HA,進一步分離提取的HA和FA,而FA保留在溶液中。將上述提取腐殖酸后的沉積物殘渣(粗胡敏素)測定的胡敏素按固液比1∶10加入到體積比為 1∶1的40%HF和2 mol/L HCL中,在80 ℃下震蕩1 h后,離心并棄去上清液。剩余的固體樣品繼續重復上述操作3次以上,然后用去離子水洗滌4次以上,干燥后記為胡敏素質量。無害化時間為統計T1～T4處理高于55 ℃持續時間,根據Yang等[13]提供方法計算全球變暖效應值(GWP)。種子發芽指數(GI):取5 mL新鮮浸提液置于底部鋪有9 cm濾紙的培養皿中,放入20顆大白菜種子,置25 ℃培養箱中培養48 h,測定根長和發芽率,根據公式(1)計算GI。

GI=(樣品的發芽率×樣品的平均根長)/(對照的發芽率×對照的平均根長)×100%

(1)

碳損失(C Loss)通過公式(2)和公式(3)計算[14]。

CH4:C排放 損失=∑MEi/TOC0×100%(i= 1, 2,3…,n)

(2)

CO2:C排放 損失=∑CEi/TOC0×100%(i= 1, 2,3…,n)

(3)

式中,MEi和CEi分別為堆肥第n天的CH4和CO2排放量,TOC0為原料混合物的初始TOC。

1.3.2 細菌微生物群落結構測定 第1天收集初始堆肥混合物(T1)并標記為D1T1,以確定堆肥材料的初始微生物群落結構。所有處理(從T1到T4)的第7天(高溫期)和第50天(腐熟期)分別記錄為D7T1、D7T2、D7T3、D7T4和D50T1、D50T2、D50T3、D50T4,使用16S rRNA高通量測序確定細菌群落結構變化,由北京諾禾致源科技股份有限公司測定。利用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組 DNA 質量,利用超微量分光光度計(NanoDrop 1000,USA)測定提取的 DNA 濃度。以343F(5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′)和515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)為DNA 引物擴增代表細菌的 16S rRNA。擴增條件:95 ℃ 預變性 2 min,接著進行25個循環,包括95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s;循環結束后72 ℃最終延伸5 min。對擴增產物切膠回收,用QuantiFluorTM熒光計進行定量。將純化的擴增產物進行等量混合,連接測序接頭,根據 Illumina 官方說明構建測序文庫,Hiseq2500的PE250模式上機測序。然后對所有樣品的全部序列進行聚類,以97 %的 相似度將序列聚類成分類操作單元(operational taxonomic units,OTUs),然后對OTUs的代表序列進行物種注釋,在unite庫比對,得到OTUs的分類學信息。使用物種對應的基因豐度總和計算該物種的豐度,并在門、綱、目、科、屬、種等各個分類學水平上統計物種在各個樣品中的豐度,從而構建相應分類學水平上的豐度譜。

1.4 數據統計與分析

利用QIME軟件分析數據,得到細菌的Alpha多樣性指數(Shannon指數)和細菌豐富度指數(Chao 1指數)和測序深度指數(Coverage指數)。試驗中的所有理化參數均測量3次。采用IBM SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)(P<0.05)。使用Origin 2022完成圖表繪制。利用SPSS AMOS 24.0軟件,采用極大似然法建立結構方程模型(SEM)。

2 結果與分析

2.1 添加NZVI對堆肥有機質和可溶性有機碳的影響

堆肥過程有機質變化如圖1-a所示。整個堆肥過程中所有處理有機質含量一直保持逐漸下降的趨勢。堆肥初始階段,T2、T3、T4處理有機質降解速率更快,導致更多的CO2排放和更高的溫度(數據上未顯示)。堆肥35 d時,T2、T3、T4處理有機質含量顯著下降,之后逐漸穩定。堆肥結束后,T2、T3、T4處理的有機質降解率分別為35.65%、36.81%和40.16%,顯著(P<0.01)高于T1(29.28%)。

圖1 堆肥過程有機質(OM)和可溶性有機碳(DOC)變化

DOC主要由低分子量有機酸、糖和酚類等易降解物質組成,易被微生物直接分解利用[15]。堆肥過程中DOC變化如圖1-b所示,所有處理呈現相似的變化趨勢。堆肥初始,T1處理DOC含量顯著(P<0.05)高于其他處理;堆肥前21 d,所有處理DOC先降低后逐漸升高,至21 d各處理DOC含量均達到峰值。堆肥22 d后各處理DOC含量逐漸下降,且在堆肥后期達到穩定。堆肥結束后,T1和T2處理DOC含量顯著(P<0.05)高于T3和T4處理,這表明添加高比例納米零價鐵能夠有效促進堆肥內化合物降解或者利用。

2.2 添加NZVI對堆肥腐殖質及其組分的影響

腐殖質及其主要組成成分(胡敏酸、富里酸和胡敏素)能夠反映堆肥過程中腐殖化進程,同時體現堆肥產品的品質[16]。堆肥過程中腐殖質含量如圖2-a所示。堆肥腐殖質主要來源于木質素、多糖和含氮成分,堆肥過程中腐殖質變化趨勢大致相同,堆肥初始階段,T2處理顯著(P<0.05)高于其他處理,最后7 dT1和T4處理略有上升。堆肥結束時各處理腐殖質降解率無顯著差別,T1、T2、T3、T4分別為33.81%、41.69%、35.40%和33.63%。

圖2 堆肥腐殖質及其組分變化

整個堆肥過程中,T1處理的胡敏酸含量顯著(P<0.01)高于T2、T3、T4處理(圖2-b)。堆肥過程中,所有處理前7 d胡敏酸含量漲幅較大,堆

肥結束后,T2、T3、T4處理胡敏酸增加效率顯著(P<0.05)高于T1處理,分別為T3(82.24%)、T4(80.71%)、T2(75.82%)、T1(53.66%)。試驗結果表明,添加NZVI在堆肥初期雖會降低胡敏酸含量,但在堆肥過程中能更快地提升胡敏酸含量,總體來看堆肥內添加NZVI不會促進胡敏酸的形成。

堆肥過程中,富里酸的變化趨勢與胡敏酸相反,所有處理呈下降趨勢,最后趨于穩定(圖2-c)。堆肥初期,所有處理富里酸含量迅速降解。堆肥結束后,富里酸含量為25.4～39.45 g/kg,T1、T2、T3、T4富里酸降解率分別為51.85%、50.90%、46.69%和41.61%。試驗表明,隨著NZVI添加量的增加,堆肥過程中富里酸的降解率逐漸下降,添加NZVI顯然抑制了堆肥過程中富里酸的降解。

胡敏素作為腐殖質的組成部分,結構復雜且不溶于酸堿。如圖2-d所示,試驗過程中胡敏素變化趨勢和富里酸大致相同,呈下降趨勢。在堆肥前中期,各處理胡敏素下降速率較快。隨著堆肥的進行,由于胡敏素內部存在較穩定和惰性組分導致胡敏素含量逐漸穩定。堆肥結束后,各處理胡敏素含量無顯著性差別,為154～169.5 g/kg,T1、T2、T3、T4胡敏素降解率分別為 38.13%、47.41%、42.37%和41.96%。試驗結果表明堆肥添加NZVI一定程度上能促進胡敏素降解。

2.3 添加NZVI對堆肥CO2和CH4排放的影響

CO2是堆肥過程中排放的主要氣體,主要由物料內氧氣和溫度控制,同時也反映了堆肥過程中有機質降解和微生物活動[17]。由圖3-a試驗過程中CO2排放變化可知,添加NZVI的處理CO2排放高峰期出現在堆肥20 d左右,這和上述有機質的變化相一致。隨著堆肥的進行,CO2排放逐漸增加,主要集中在堆肥升溫期和高溫期,此階段T1、T2、T3、T4的CO2排放占總排放量的 63.71%、67.53%、65.82%和61.08%。之后隨著物料內易降解物質的消耗,各處理日排放量逐漸降低,僅有T3和T4處理在45 d左右出現小高峰。整個堆肥過程中T1、T2、T3、T4處理日排放量最大值分別是150.72、160.20、204.81和274.05 g/d,較T1處理分別增加6.29%、35.89%和81.83%。整個堆肥過程T1、T2、T3、T4處理CO2累積排放量分別是1 546.66、2 332.72、2 831.97和3 159.91 g,較T1處理分別增加50.82%、83.10%和1.04倍。

圖3 堆肥過程氣體日排放量及累計排放量

由整個堆肥過程中各處理CH4日排放量和累積排放圖3-c、3-d可知,整個堆肥過程中,CH4排放主要集中在前中期。T1、T2、T3處理CH4日排放在堆肥第17天左右快速上升,并達到峰值,分別為1.19、1.82、1.11 g/d,T4處理CH4日排放峰值出現在23 d,值為1.80 g/d,這和CO2變化相一致,之后隨著堆肥的進行,各處理CH4日排放逐漸降低并可以忽略不計。T2、T3、T4處理CH4累積排放量分別為5.46、5.44和5.99 g,較T1處理(2.39)分別增加1.28倍、1.28倍和1.51倍。

2.4 添加NZVI堆肥的碳循環和碳平衡

使用環境指標(碳損失、全球升溫潛力)、肥料指標(有機質含量)和種子發芽指數(GI)評估所有試驗的環境影響(圖4-a)。T1、T2、T3、T4處理的GWP值分別為1.6、2.3、2.8和3.2 kg CO2當量,僅考慮CO2和CH4排放量。堆肥過程中碳的損失主要是CO2和CH4,其中CO2損失占總碳損失率均在99%以上。T1、T2、T3、T4堆肥產品的GI分別為103%、95%、96%和99%。在這種情況下,所有處理都達到了無害要求(GI>80%),表明該產品用于肥料的安全性。T1、T2、T3、T4的無傷害時間分別為42 d、40 d、28 d和26 d。如圖4-b所示,使用SEM對有機質去向關系進行分析。結果表明,有機質主要降解為胡敏素,隨著NZVI添加比例的增加,有機質(T3,λ = 1.77,P<0.05)、HA(T3,λ =-0.23,P<0.05)和FA(T4,λ = 0.07,P<0.01)向DOC的轉化明顯增加。有趣的是,HA是由T1、T2、T3中的FA和T3、T4中的胡敏素轉化形成的。DOC對HA的形成無明顯影響。

OM.有機質;DOC.水溶性有機碳;HA.胡敏酸;FA.富里酸;GI.種子發芽指數;GWP.全球變暖效應值;* P<0.05,** P< 0.01,*** P<0.001

2.5 添加NZVI土壤堆肥微生物群落結構變化

如圖5-a所示,本研究所有樣本的覆蓋率均超過99%,這說明數據準確性[18]。選擇利用Chao 1指數和Shannon指數描述微生物群落的豐富度和多樣性,初始物料的Chao 1指數(1 269.33)和Shannon指數(7.24)均較高,說明初始物料內營養成分滿足細菌的生長代謝,微生物數量和種類滿足堆肥啟動要求。高溫期所有處理的Chao 1指數和Shannon指數均低于初始值。與高溫期T1處理相比,T2處理Chao 1指數較大,T3和T4均有所下降,Shannon指數表現出相同的趨勢。而腐熟期Chao 1指數和Shannon指數較T1處理同樣有所降低,但是隨著納米零價鐵添加比例的升高,Chao 1指數和Shannon指數逐漸升高。

圖5 堆肥過程微生物群落結構變化

本試驗選擇初始階段、高溫期和腐熟期3個時期堆肥樣本進行細菌相對豐度的分析,不同處理不同時期細菌門相對豐度如圖5-b所示。堆肥初期優勢菌門主要包括厚壁菌門(Firmicutes)(50.77%),放線菌門(Actinobacteria)(15.78%),擬桿菌門(Bacteroidota)(12.89%),變形菌門(Proteobacteria)(7.56%)和廣古菌門(Euryarchaeota)(6.34%)。高溫期樣品中,隨著納米零價鐵添加比例的升高,厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度逐漸增加,D7T1、D7T2、D7T3、D7T4占比分別為58.46%、77.34%、85.31%和88.17%。同時較D7T1相比,納米零價鐵能顯著(P< 0.05)降低放線菌門(Actinobacteria)豐度,同時廣古菌門(Euryarchaeota)和未定義菌門(Undefined_Bacteria)相對豐度也較初始時降低,說明添加納米零價鐵會降低物料內微生物種類。當堆肥進入腐熟階段后,厚壁菌門(Firmicutes)細菌活性下降,擬桿菌門(Bacteroidota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)相對豐度逐漸上升。其中綠彎菌門(Chloroflexi)相對豐度也隨著納米零價鐵的增加而增加,同時腐熟期放線菌門(Actinobacteria)相比于高溫期也略有增加,這也符合堆肥內添加納米零價鐵導致有機質降解率較高的結果。

圖5-c為不同堆肥階段微生物群落在屬水平上相對豐度(>3%)的變化。初始物料中,梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)、棒狀菌屬(Corynebacterium)、產甲烷菌屬(Methanobrevibacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、土胞桿菌屬(Terrisporobacter)、鏈球菌屬(Streptococcus)和八疊球菌屬(Sporosarcina)相對豐度達到40%以上。高溫期,各處理優勢菌屬略有區別,D7T1優勢菌屬分別為棒狀菌屬(Corynebacterium)(23.94%)、芽孢桿菌(Bacillus)(14.92%)和八疊球菌屬(Sporosarcina)(13.62%)。相比于D7T1、D7T2和D7T4的八疊球菌屬(Sporosarcina)顯著(P<0.05)增加,分別為43.80%和 48.55%,D7T3處理優勢菌屬為芽孢桿菌(Bacillus),占比為41.27%,其次是八疊球菌屬(Sporosarcina),占比13.62%。堆肥結束后,D50T2顯著增加瘤胃絲狀桿菌(Ruminofilibacter)相對豐度,達到55.84%,D50T3和D50T4也略有增加,但都低于對照。D50T3和D50T4較D50T1相比,球形桿菌(Sphaerobacter)和海藤黃色單胞菌(Luteimonas)相對豐度均勻一定程度增加。

3 討 論

試驗結果表明,隨著NZVI添加比例的增加,豬糞堆肥有機質降解越多,CO2排放量也相應增加,但由于有機質快速降解也導致好氧微生物的需氧量不足,從而造成物料內產生較多兼性或厭氧區域,進而表現出NZVI會促進CH4的排放[19]。此外,也可能是NZVI與物料內水發生反應產生H2,提高了嗜氫型產甲烷菌的活性,從而對產甲烷過程有一定的促進作用[20],同時Fe會降低體系內氧化還原電位,從而影響細胞內電子轉移狀況而進一步影響微生物代謝活動[21]。

整個堆肥過程中,T1處理胡敏酸含量顯著(P<0.01)高于T2、T3和T4處理,與已有研究相反[12],這可能是因為NZVI表面的鐵氧化物與胡敏酸表面羧基官能團發生絡合反應[12],隨著堆肥的進行,T2、T3、T4處理在堆肥前7 d胡敏酸顯著增加,直到堆肥結束。NZVI能顯著增加胡敏酸含量,這可能是因為NZVI的高還原能力以及形成的絡合結構能提高胡敏酸的抗氧化能力,降低其礦化速率,這與已有研究一致[22-23]。就富里酸而言,其作為腐殖質內結構相對簡單,分子量較小的組分,在堆肥過程中會被優先礦化,但NZVI添加會抑制富里酸的降解,這可能是因為吸附在NZVI表面的富里酸具有更高的化學穩定性,在NZVI體系下,會有一部分胡敏素轉化為富里酸,從而影響堆肥過程富里酸的降解[24]。胡敏素作為腐殖質內最為穩定的部分,它主要有惰性組分和表面活性官能團組成,堆肥前期較高的降解率可能是因為胡敏素表面與胡敏酸結合部分被微生物分解利用,雖然NZVI添加會在一定程度上增加胡敏素的降解或者轉化,但是由于胡敏素的難提取性[25],導致NZVI對其具體的作用機制目前尚未闡明,這也值得進一步研究。

從微生物角度來看,將初始階段、高溫期和腐熟期3個階段樣品進行細菌相對豐度分析,堆肥初期優勢菌門主要包括厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidota)。高溫期隨著堆肥溫度的升高,厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度逐漸增加,這說明Firmicutes在高溫條件下競爭優勢更大,這是因為Firmicutes常出現在厭氧條件下,尤其是體系內有較多有機酸累積時,這也驗證了NZVI處理CH4排放較高結果的原因[26],同時有研究表明Firmicutes能夠有效利用堆肥前期易降解有機物,且在惡劣環境耐受性更強[27]。同時與D7T1相比,NZVI能顯著降低放線菌門(Actinobacteria)豐度,相關研究表明Actinobacteria是抗生素的某些載體,因此這也暗示了NZVI添加能夠消減物料內抗性基因;堆肥進入腐熟階段,綠彎菌門(Chloroflexi)相對豐度也隨著NZVI添加比例的增加而增加。有研究表明綠彎菌門(Chloroflexi)微生物可以降解物料內纖維素類物質,這也從微生物角度證明堆肥內添加NZVI可以促進有機質降解[28]。從細菌屬角度來看,高溫階段添加NZVI處理(D7T2、D7T4)主要菌屬為八疊球菌屬(Sporosarcina),D7T3處理主要優勢菌屬為芽孢桿菌(Bacillus),這兩類細菌均可在高溫條件下釋放芽孢來抵御高溫環境,結果表明NZVI作為添加劑可以促進嗜熱期芽孢桿菌類細菌。堆肥進入腐熟期,不同NZVI添加量堆肥系統內優勢菌屬變化不一致,其中D50T2處理顯著增加瘤胃絲狀桿菌(Ruminofilibacter)相對豐度,其作為厭氧系統內主要細菌屬,具有半纖維素酶活性[29];D50T3、D50T4較D50T1相比顯著增加球形桿菌(Sphaerobacter)和海藤黃色單胞菌(Luteimonas)相對豐度,其中球形桿菌(Sphaerobacter)已被證實能夠降解物料內碳水化合物和纖維素[30],而海藤黃色單胞菌(Luteimonas)在生物脫毒方面有一定的作用,利于堆肥產品達到衛生要求[31]。總之,NZVI可以促進物料內難降解類如纖維素、半纖維素和木質素類物質降解,同時提高堆肥產品的脫毒,可用于有機物料的快速堆肥化處理。

4 結 論

添加NZVI會促進豬糞堆肥有機物質的降解,T1～T4處理分別為29.28%、35.65%、36.81%和40.16%,但對堆肥過程腐殖物質的增加無顯著促進作用。與不添加NZVI處理相比,添加NZVI能使CO2和CH4排放增加分別增加 50.82%～1.04倍和1.28倍～1.51倍。添加NZVI會增加有機質分解相關微生物的活性,提高有機質降解率,降低堆肥產品毒性,有利于有機物料的快速堆肥化處理。