5個烏骨雞品種線粒體 ND6基因遺傳多樣性及系統進化分析

賈曉旭,唐修君,陸俊賢,樊艷鳳,顧 榮,馬尹鵬,黃勝海,葛慶聯,高玉時

(江蘇省家禽科學研究所,江蘇揚州 225125)

種質資源是農業高質量發展的“芯片”,是解決中國畜牧業種源“卡脖子”問題的物質基礎。中國是世界上雞遺傳資源最豐富的國家之一,經過國家畜禽遺傳資源委員會鑒定的地方雞品種已經有116個。經過中國勞動人民長期的人工選擇和馴養,形成了以烏骨雞為代表的獨特的變異性狀和特有的種質資源。400多年前明代醫藥家李時珍所著《本草綱目》一書中,就有烏骨雞的記載:“烏骨雞,有白毛烏骨者,黑毛烏骨者、斑毛烏骨者,有骨肉皆烏者、肉白烏骨者,但觀雞舌黑者,則骨肉俱烏、入藥更良”[1],對這些具有優勢特色性狀的種質資源進行評價是一項十分重要的工作。

目前對雞種質資源進行評價的分子標記很多,應用較多的為全基因組水平的遺傳標記[2]、微衛星標記[3]和線粒體DNA標記[4]。雞線粒體基因組全長約16 kp,具有進化速率快、基因結構簡單、缺少基因重組和母系遺傳等特點,被廣泛用于研究種群的起源進化、遺傳多樣性和品種鑒定等方面[5-8]。目前對雞線粒體DNA的研究多集中于線粒體控制區(D-loop區)[9]、C氧化酶亞基I(cytochrome C oxidase subunit,COI)[10]、細胞色素b基因(cytochrome b,Cytb)[11]等,利用NADH脫氫酶基因研究雞遺傳多樣性和系統進化關系相對較少。在NADH脫氫酶中,NADH 脫氫酶亞基6(NADH dehydrogenase subunit 6,ND6)基因具有序列片段短、進化速率中等、不含影響測序的復雜結構、含有高分辨率的系統發育信息等優點,適合研究物種的遺傳多樣性和系統進化關系。目前,利用ND6基因對中國烏骨雞的遺傳多樣性和系統進化的研究尚未見報道。本研究以中國烏骨雞地方品種(絲羽烏骨雞,東鄉綠殼蛋雞,金湖烏鳳雞,余干烏骨雞)和商業化烏骨雞品種(新興竹絲雞3號配套系,親本為絲羽骨雞和隱性白羽雞,以下簡稱竹絲雞)為材料,以線粒體ND6基因全序列為分子標記,評估其線粒體DNA的遺傳多樣性和系統發育關系,以期為中國烏骨雞品種的保護、選育及資源鑒定提供理論 依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

絲羽烏骨雞群體1(n=30)、東鄉綠殼蛋雞(n=30)和金湖烏鳳雞(n=30)樣品來自國家級地方雞種基因庫(江蘇),絲羽烏骨雞群體2(n=42)樣品來自江西省泰和縣泰和雞原種場、余干烏骨雞樣品(n=36)來自余干縣畜禽良種場,竹絲雞樣品(n=30)來自太倉溫氏畜牧有限公司。所有采樣品種內個體間沒有直接的親緣關系。用血液DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取基因組DNA,-80 ℃保存,備用。

1.2 試驗方法

PCR擴增和測序所用引物相同,正向引物:5′-CCCACAATCGGAACACTA-3′;反向:5′-TCTAACCAAGCGGGAATA-3′,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系總體積為50 μL,模板DNA(100～200 ng)2 μL, 2×PCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)25 μL,10 μmol/L上下游引物各 1 μL,滅菌水21 μL。PCR反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,運行35個循環;再72 ℃延伸7 min;最后4 ℃終止反應。PCR產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測,確認擴增片段與目的片段一致后,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3 數據處理與分析

用DnaSP 5.10.1軟件統計核苷酸多樣性、單倍型多樣性、平均核苷酸差異、變異位點數、單一突變位點數、簡約信息位點數和單倍型數[12]。用MEGA 7.0軟件統計序列的平均堿基組成、品種內和品種間的遺傳距離,采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建系統發育樹[13]。采用Network 10.2.0軟件繪制Median-joining單倍型網絡圖[14]。

2 結果與分析

2.1 線粒體 ND6基因序列變異分析

PCR擴增片段長度為732 bp,減掉兩端非ND6基因序列區域片段,成功獲得197條完整的線粒體ND6基因序列,長度全部為522 bp,沒有發現插入或缺失。堿基T、C、A和G的平均比例分別是10.27%、38.77%、41.50%和9.46%, A+T的平均含量為51.77%,略高于G+C的含量48.23%,表現出一定的AT堿基偏好性,與鳥類線粒體DNA堿基組成的特征相符。

利用DnaSP 5.10.1軟件對197條序列進行單核苷酸多態性分析,共檢測到8處多態位點(表1),占核苷酸序列總長度的1.53%(8/522),其中2個單一突變位點位于204、467位,6個簡約信息位點位于64、70、178、253、403和418位。所檢測到的8處多態位點均為轉換,其中A/G之間轉換4 次,T/C之間轉換4 次。

表1 基于 ND6基因序列變異信息的烏骨雞單倍型分類

2.2 線粒體 ND6基因單倍型多樣性分析

基于197條烏骨雞序列發現的8個多態位點,共界定8種單倍型,命名為Hap1～Hap8。各單倍型的數量及在品種間的分布見表1和表2。其中單倍型Hap1出現頻率最高,共68次;其次是單倍型Hap6,為58次;然后是單倍型Hap4為54次。Hap1、Hap2、Hap4和Hap6為共享單倍型,其中Hap4和Hap6在所有群體都有檢測到;Hap1除絲羽烏骨雞2個群體,其他品種均能檢測到;Hap2除絲羽烏骨雞群體1和竹絲雞,其他群體均能檢測到。Hap3、Hap5、Hap7和Hap8為獨立單倍型,Hap3只分布于余干烏骨雞,Hap5只分布于東鄉綠殼蛋雞,Hap7和Hap8分別只分布于絲羽烏骨雞群體1和余干烏骨雞。

表2 6個烏骨雞群體單倍型分布

2.3 不同品種遺傳多樣性和距離分析

6個烏骨雞群體遺傳多樣性見表3?？傮w單倍型多樣性為0.720±0.012,最高的為東鄉綠殼蛋雞為0.766±0.042,最低的竹絲雞為0.191±0.093?？傮w核苷酸多樣性為0.002 91± 0.000 92,東鄉綠殼蛋雞核苷酸多樣性最高為 0.003 83±0.001 08,竹絲雞最低為0.000 85±0.000 84。平均核苷酸差異為1.518,余干烏骨雞平均核苷酸差異最高為1.998,竹絲雞最低為 0.444。

表3 6個烏骨雞群體的遺傳多樣性

基于Kimura雙參數模型計算6個群體烏骨雞的遺傳距離見表4,可以看出6個群體品種內遺傳距離為0.000 86～0.003 87,竹絲雞最低,東鄉綠殼蛋雞最高。品種間遺傳距離為0.000 10～0.003 29。竹絲雞與2個絲羽烏骨雞群體之間的遺傳距離較遠,雙參數距離分別為0.003 29和 0.001 57;余干烏骨雞與金湖烏鳳雞的遺傳距離最近,雙參數距離值為0.000 10。

表4 基于Kimura雙參數模型計算的6個烏骨雞群體品種內和品種間平均遺傳距離

2.4 系統進化關系分析

用Network 10.2.0構建6 個烏骨雞群體的中介網絡圖,如圖1所示,6 個烏骨雞群體以Hap6為中心呈星狀發散分布,沒有按雞體型外貌或地理來源的不同進行分類,只是在單倍型分布和比例存在差異。絲羽烏骨雞群體1包含3種單倍型,Hap4單倍型在該雞群體中占優勢;絲羽烏骨雞群體2有3種單倍型,Hap6單倍型在該群體中占優勢;東鄉綠殼蛋雞、金湖烏鳳雞、余干烏骨雞和竹絲雞分別有5、4、6和3 種單倍型,優勢單倍型都為Hap1。采用NJ法構建6 個群體的系統發育樹(圖2),發育樹分成2 個大枝,絲羽烏骨雞群體1和絲羽烏骨雞群體2聚為一支,東鄉綠殼蛋雞、金湖烏鳳雞、余干烏骨雞和竹絲雞聚成一支。

不同顏色表示不同群體

圖2 基于mtDNA ND6基因采用NJ法構建的系統發育樹

3 討 論

5個品種烏骨雞線粒體ND6基因序列的堿基T、C、A和G的平均比例分別是10.27%、38.77%、41.50%和9.46%,并且G含量最低,顯示出較明顯的堿基偏倚,這是由于蛋白質編碼基因的核苷酸突變在密碼子第3位點上受到的自然選擇壓力較小所致,證明密碼子第3位點能夠更清晰地表明線粒體基因組核苷酸組成的不均一性[15]。序列變異一般認為是生物適應環境變化的結果,是產生生物多樣性的根本來源,本研究發現烏骨雞mtDNAND6基因序列長度為522 bp,發現的8處多態位點為64～467 bp,具有較高的突變率,可作為雞遺傳多樣性和起源進化研究的分子標記。

核苷酸多樣性和單倍型多樣性是衡量群體遺傳多樣性高低的兩個重要指標,數值越大,具有較大的適應能力、生長能力和進化潛力,更容易開拓新環境[16]。本研究結果發現除5個烏骨雞品種除東鄉綠殼蛋雞和余干烏骨雞具有很高的遺傳多樣性以外,其他品種均處于較低水平。絲羽烏骨雞群體2(樣本來自原產地群體)的遺傳多樣性大于絲羽烏骨雞群體1(樣本來自基因庫保種群體),并且在單倍型分布比例上存在差異,可能與保種地和原產地環境差異有關,提示保種過程中要定期與原產地群體進行基因交流[17]。竹絲雞作為商業化品種,單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別只有0.191和0.000 85,品種內遺傳距離為0.00 86,均低于其他烏骨雞地方品種。這種現象說明品種培育過程中,為了提高生產性能進行高強度人工選擇會使群體的遺傳多樣性大大降低。

絲羽烏骨雞已經有數百年的繁衍歷史,曾作為珍貴貢品上供朝庭,是中國最古老的雞品種之一。絲羽烏骨雞外貌與其他雞種有明顯的不同,標準的絲羽烏骨雞具有“十全”特征:桑葚冠、纓頭、胡須、綠耳、絲羽、毛腳、五爪、烏皮、烏肉和烏骨。同時絲羽烏骨雞具有性情溫馴、適應性強、外形美觀、肉質鮮嫩、藥用功能,是藥、肉、蛋、觀賞兼用型多用途雞種[1]。同中國其他地方雞品種一樣,絲羽烏骨雞生產性能不高,通過本品種選育很難有大幅度提升。竹絲雞是在絲羽烏骨雞基礎上培育而成。竹絲雞和絲羽烏骨雞雖然體型外貌相似,但生長速度和繁殖性能都得到大幅度提升,最終產品的價格也要便宜很多。本研究表明竹絲雞與兩個絲羽烏骨雞群體之間的母系遺傳距離較遠,雙參數距離值分別為0.003 29和0.001 57,與竹絲雞父本來自絲羽烏骨雞,母本來自隱性白羽肉雞培育過程相符。同時可基于二者單倍型的不同,進行絲羽烏骨雞和竹絲雞產品甄別,保證優質優價。

線粒體作為細胞器位于細胞核外,線粒體DNA的遺傳信息是通過卵細胞傳遞給下一代,同時線粒體DNA變異具有累積效應,來自同一母系的單倍型會聚類在一起,稱為線粒體單倍型類群。本研究中6個烏骨雞群體以Hap6為中心呈星狀發散分布,沒有像D-loop區序列一樣形成多個單倍型類群,可能與ND6基因進化速率低于 D-loop區有關,但過高的進化速率會產生重復突變,從而干擾系統發育樹的構建,特別是在種間及以上的系統發育分析中不能準確地反映各個支系的關系[5]。雞的線粒體基因組長度一般為 16 783～16 787 bp,除了線粒體D-loop區,還包含13個編碼蛋白基因、22個tRNA基因、2個rRNA基因(12S rRNA和16S rRNA),包含更多的遺傳信息[18],因此本研究認為利用線粒體基因組或幾個不同區域的序列組合能夠更為全面準確地掌握雞的母系起源情況。

4 結 論

烏骨雞線粒體ND6基因多態信息含量豐富,可作為遺傳多樣性和起源進化的研究分子標記。東鄉綠殼蛋雞和余干烏骨雞具有豐富的遺傳多樣性,絲羽烏骨雞和金湖烏鳳雞的遺傳多樣性相對較低,商業化品種竹絲雞的遺傳多樣性處于極低水平?？梢岳弥窠z雞與絲羽烏骨雞母系來源的不同,開發線粒體分子標記區分竹絲雞和絲羽烏骨雞。