CRISPR/Cas9技術(shù)在工業(yè)微生物中的應(yīng)用*

張才達 祁永浩 米雅萱 張?zhí)N之 秦浩杰 劉東 李小兵 任麗梅**

（1）石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北省高校微生物制藥應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，石家莊 050035；2）美邦美和生物科技有限公司，石家莊 050000）

基因編輯作為代謝工程、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域的重要技術(shù)，一直以來都是研究的熱點。傳統(tǒng)的基因編輯方法如同源重組，存在打靶效率低、操作煩瑣等問題。隨后出現(xiàn)的鋅指核酶技術(shù)（zinc-finger nucleases，ZFN）［1］和轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)蛋白核酸酶技術(shù)（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）［2］，雖一定程度上提高了編輯效率，簡化了編輯步驟，然而這兩個技術(shù)也因難度較大、費用較高等原因，應(yīng)用范圍受到限制。相對而言，近年來發(fā)展的CRISPR技術(shù)，具有操作難度小、編輯成本低、打靶效率高、無痕編輯等優(yōu)點，特別適用于微生物底盤細(xì)胞的編輯。改造后的或新創(chuàng)造的底盤細(xì)胞，更有利于實現(xiàn)特定的生物功能從而實現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的大量積累。本文主要簡述以規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9為基礎(chǔ)而衍伸出的各種基因編輯技術(shù)，提出了常用的工業(yè)微生物對應(yīng)底盤細(xì)胞的改造策略，以期為研究者在進行微生物底盤細(xì)胞改造時提供參考。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)由3個功能組分組成：crRNA（CRISPR RNA，crRNA）、tracrRNA（trans-activating CRISPR RNA，tracrRNA）及Cas9蛋白。三者結(jié)合為復(fù)合物，識別特定的NGG序列，即前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）區(qū)，crRNA通過堿基互補配對與附近間隔序列作用，Cas9蛋白負(fù)責(zé)對特定靶標(biāo)DNA進行雙鏈斷裂，在實際應(yīng)用過程中crRNA和tracrRNA通常被結(jié)合在一起簡化為小向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA）［3］。圖1a和1b分別展示了CRISPR系統(tǒng)組成及Cas9核酸酶功能結(jié)構(gòu)域。不難發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)有兩個重要特點：一是crRNA可以通過堿基互補配對原則精確識別基因組靶位點；……