蕨麻cpSSR序列特征分析

田甜 李軍喬 王鑫慈 曲俊儒

摘要 基于NCBI數據庫中收錄的蕨麻葉綠體基因組序列，利用REPuter軟件和MISA軟件分析其微衛星分布規律。結果顯示，在葉綠體基因組中共檢測到34個散在重復序列，22個分布在LSC區，10個分布在IR區，2個分布在SSC區。使用MISA 共注釋到92個SSR位點，平均每1 820 bp出現1個SSR位點。SSR主要分布在LSC區（79.07%），重復序列主要以單堿基為主，占總數量的86.05%。微衛星長度平均為12 bp，大多數長度為10 bp，說明蕨麻中重復基元較短的微衛星變異速率較快。

關鍵詞 蕨麻；葉綠體基因組；微衛星

中圖分類號 Q 943? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2023）12-0094-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.021

Characterization Analysis of Microsatellite in Chloroplast of Potentilla anserina

TIAN Tian1，2，LI Jun-qiao1，2，WANG Xin-ci1，2 et al

（1.The College of Ecological Environment and Resources，Qinghai Minzu University，Xining，Qinghai 810007.2.Tibetan Plateau Juema Industry Research Institute，Xining，Qinghai 810007）

Abstract The chloroplast genome sequences of Potentilla anserina L. was used to analyze the distribution of microsatellite from Gen Bank Database.It was analyzed with bioinformatics software REPuter and MISA.The results showed that it owned a total of 34 dispersed repetitive sequence in the chloroplast genome of Potentilla anserina L.，mainly distributed in the large single-copy region and Inverted repeat，22 and 10 respective，the small single-copy region merely 2.Using the MISA found 92 microsatellites in the chloroplast genome of Potentilla anserina L.One SSR locus per 1 820 bp.Mainly distributed in the large single-copy region （79.07%），the most commom repeat type of the cpSSR is mononucleotide repeat which accountede for 86.05%.The average length of SSR is 12 bp，mainly concentrated in 10 bp，which suggested that the shorter length of SSR in Potentilla anserina L.is change faster.

Key words Potentilla anserina L;Chloroplast genome;SSR

基金項目 青海省重點研發與轉化計劃項目（2022-NK-120）；青海民族大學2021年研究生創新項目（954M2021005）。

作者簡介 田甜（1997—），女，貴州銅仁人，碩士研究生，研究方向：藥用植物資源開發與利用。*通信作者，教授，博士生導師，從事藥用植物資源開發與利用研究。

收稿日期 2023-01-08

蕨麻（Potentilla Anserina L.），是薔薇科（Rosaceae）鵝絨委陵菜的一個變種，在我國西部地區尤其是青藏高原地區因塊根膨大而被稱為蕨麻，亦稱“人參果”［1］。蕨麻地上和地下部分均有豐富的營養價值，尤其是地下塊根部分，研究發現，蕨麻塊根中含有黃銅、鞣質、多糖、皂苷等活性成分，具有降血糖、降血脂、抗凝血、抗氧化、健脾益胃等作用［2］；地上部分含有粗蛋白質、粗脂肪、粗纖維等成分［3］。因此，蕨麻可作為青藏高原優質藥食兩用植物資源。劉素君等［4］通過提取蕨麻多糖，將其作用于人肝瘤SMMC-7721細胞的體外增殖抑制作用，結果表明，蕨麻多糖對其生長的抑制作用最高可達43.57%，同時對T-淋巴細胞和巨噬細胞的吞噬率有顯著提高，說明蕨麻多糖在腫瘤的治療上有很大作用；Chen等［5］研究發現，蕨麻可以有效增加免疫細胞數量，從而達到增強免疫力的效果。在日常飲食中，西部地區尤其是高原地區農牧民，經常用蕨麻熬粥，以此來提高免疫力和抗缺氧能力，且效果顯著。目前，對于蕨麻的研究大多集中在成分提取、品種選育及藥用價值等方面，較少有在分子水平上的研究報道［2-3，6-7］。2022年5月Tang等［8］對蕨麻葉綠體全基因組完成了測序（NCBI接收號：MW174249.1），并分析了序列結構，而筆者在此基礎上，對葉綠體中的微衛星進行進一步分析，為后續物種的品種鑒定、種質遺傳多樣性及序列引物設計等奠定基礎。

葉綠體微衛星（chloroplast microsatellite）又稱葉綠體SSR（chloroplast simple sequence repeats，cpSSR），分布在葉綠體上的長度不超過200 bp的簡單重復序列，它既有微衛星含有較多遺傳信息的特點［9］，又具備了葉綠體基因組進化速率適中且穩定遺傳的優點［10］，常被用于物種進化水平、群體遷移等相關研究［11-12］，因此被廣泛應用。王崇等［13］利用cpSSR對104個甘薯品種成功構建了指紋圖譜；韓巖［14］利用7對cpSSR引物對三七居群進行了遺傳多樣性分析，明確了居群之間的遺傳性；李航等［15］用cpSSR和nSSR標記明確了地方柑橘“枳雀”的親本和來源。cpSSR在種質資源的開發與利用、物種遺傳、品種鑒定以及序列引物設計等方面都發揮著巨大用處。筆者利用NCBI數據庫中下載的蕨麻葉綠體基因組數據，分析其微衛星序列的分布、組成、長度等特征，以期為后續蕨麻cpSSR遺傳多樣性研究以及引物序列設計研究提供信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從NCBI的GenBank數據庫下載蕨麻（Potentilla anserina）的葉綠體基因組完整序列數據和注釋文件（NCBI接收號：MW174249.1）［8］，分別以.fasta和gb格式保存。

1.2 試驗方法

使用REPuter［16］在線軟件，參數設置如圖1所示，分析蕨麻葉綠體基因組中的序列，對各散在重復序列位點所處的基因位置等分布信息進行分析；使用MISA（MIcroSAtellite identification tool，MISA，https：//webblast.ipk-gatersleben.de/misa/）［17］分析蕨麻葉綠體基因組中的序列，設置參數：單堿基重復次數為12次以上，二堿基重復次數為6次以上，三堿基重復次數為4次以上，四堿基、五堿基以及六堿基重復次數都在3次以上。

2 結果與分析

2.1 蕨麻葉綠體基因組重復序列

基于REPuter程序，檢測到蕨麻葉綠體基因組上共有34個散在重復序列，分為Forward（F），Palindromic（P），Complement（C）3種類型，分別占比52.94%、44.12%和2.94%（表1）。

從圖2可知，重復序列有22個在LSC區，占比64.71%；IR區有10個，占比29.41%；SSC區只有2個，占比5.88%。Palindromic在LSC區、IR區、SSC區分別有9、5和1個，Forward分別有12、5和1個；Complement在SSC區和IR區沒有分布，只在LSC區分布有1個。可見，重復序列雖然在3個區域都有分布，但分布不均勻。

2.2 蕨麻葉綠體基因組SSR

2.2.1 SSR位點分布。

使用MISA識別蕨麻葉綠體基因組中的SSR位點，結果顯示，在總長為156 488 bp的葉綠體基因組中，共檢測出86個SSR位點（不含復合型的位點，若將其考慮在內，則共有92個SSR位點），總長為1 030 bp，占總基因組的0.66%，分布廣泛，從177～155 708 bp均有分布，平均每1 820 bp出現1個SSR位點。其中，在LSC區、SSC區以及IR區分別分布有825、113和92 bp，分別占比80.10%、10.97%和8.93%。分析SSR數量比例結果顯示（表2），蕨麻中SSR主要分布在LSC區，其次為SSC區，IR區分布最少。

2.2.2 SSR堿基組成與豐度。

在蕨麻葉綠體SSR中，單堿基重復基序最多，有74個為單堿基，占總重復的80.43%，主要基序組成是A和T，分別有27個（36.49%）和45個（60.81%），以C和G為基序的只有2個，僅占2.7%。其次為四堿基，有8個，占總重復的8.70%，其中以AAAT/ATTT基序最多，占比50%。二堿基和三堿基的數量相同，均為5個，分別占5.43%，主要以A和T基序組成，不含G和C。SSR中未發現五堿基基序及以上堿基序列組成。通過計算，所有類型的SSR中，單堿基豐度最高，為482.45個/Mb；最低為二堿基和三堿基，均為35.50個/Mb（表3）。

2.2.3 SSR長度與基序拷貝數分布。

由圖3可知，蕨麻葉綠體微衛星長度平均為12 bp，最長為18 bp，最短為10 bp，12 bp的SSR數量最多，有24個，占比27.91%；其次為長度為10 bp的SSR數量，有21個，占比24.42%；最少為16和18 bp，分別僅有1個，占比1.16%。

蕨麻葉綠體微衛星拷貝數3～18不等，基序越長，則拷貝數越少，序列數也越少（圖4）。單堿基拷貝數10～18均有分布，范圍最大，序列數隨著拷貝數的增大而減少，重復序列最多的是拷貝數為10的序列，共有22個（29.73%）；拷貝數為18的序列最少，僅有1個（1.35%）。二堿基拷貝數范圍比較窄，僅有6和7次拷貝，各有4和1個重復序列。三堿基和四堿基中拷貝數分別為4和3。從圖4可看出，拷貝數與序列數量呈負相關。

3 討論與結論

使用REPuter程序檢測出蕨麻葉綠體基因組中有34個散在重復序列，大部分分布在LSC區（22個），而分布在IR

區（10個）的比分布在SSC區（2個）多，可能為進化過程中，為了提高遺傳效率，生物體保留較少，但重要的遺傳信息已達到高效遺傳的目的［18］，因此在IR區的分布比在SSC區更多。

使用MISA軟件在總長為156 488 bp的蕨麻葉綠體基因組檢測出中有86個葉綠體微衛星，平均每1 820 bp出現1個微衛星，分布密度為576個/Mb。相對于其他植物，如狗棗獼猴桃（A.kolomikta）中平均每3 840 bp出現1個，分布密度273個/Mb［19］；小黨參（C.minima）中平均每5 839 bp出現1個，分布密度180個/Mb，以及秦嶺黨參（C.tsinlingensis）中平均每4 601 bp，分布密度228個/Mb出現1個［20］，蕨麻中葉綠體微衛星數量仍占優勢。

蕨麻cpSSR主要以單堿基為主，重復基序越長，數量越少，這與序列的穩定性有關［21］。分析SSR基序發現，主要以單堿基為主，尤其以A/T基序最多。在其他堿基重復類型中同樣以基序A和T最多。研究發現［22-23］，植物葉綠體基因組中的CpG甲基化極和T進行轉化，從而使G和C含量變少，而A和T基序變多，同時，熱力學的穩定也需要較少的GC含量來維持。蕨麻葉綠體基因組中，單堿基A/T基序占比97.30%；二堿基和三堿基中都是以基序A和T組成，而四堿基中只有2個含有基序C和G，其他都是基序A和T。紫花鳳梨（Tillandsia cyanea）［24］、蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite）［25］、丹參（Asparagus officinalis）［26］等植物均以單堿基重復序列為主，且基序A和T為主要組成。

蕨麻葉綠體微衛星長度平均為12 bp，長度為12 bp的重復序列數最多，其次為10 bp，二者共有45個，占比52.33%。長度大于15 bp的只有4個，占比僅為4.65%。說明長度越長，微衛星豐度呈反向趨勢。吳東洋等［19］研究認為，基序長度的變化可以反映出微衛星序列失去或獲得重復基元的速率。一般認為，當基序長度大于等于20 bp時，序列具有較好的多態性［27］。該研究中蕨麻葉綠體SSR長度平均只有12 bp，且都在20 bp以下，這與微衛星變異速率有關［19］。

微衛星長度與其選擇壓力呈正相關，與拷貝數呈負相關。因此，在中長短長度的微衛星中，其選擇壓力較少，拷貝數越多，因而變異速率也更為快速，更傾向于擴張［28］；長度較長的微衛星拷貝數較少，自身相對穩定，變異速率也就相應降低。

葉綠體微衛星有進化速率慢、穩定且分子量小的優點，可以為植物進化速率研究等提供便利條件，因此，掌握物種中微衛星的特征是前提。該研究分析蕨麻中葉綠體微衛星的特征，可以為后續微衛星引物開發奠定基礎，為蕨麻種質圖譜構建、分子育種及品種鑒定等方面的研究提供理論基礎。

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