用“掃雷游戲”原理標識新型冠狀病毒核酸檢測中的可能交叉污染孔*

張海龍,牟小會,王 萍,滕 敏

貴州省安順市人民醫院醫學檢驗科,貴州安順 561000

新型冠狀病毒核酸檢測既是確診新型冠狀病毒感染病例和無癥狀感染者的實驗室依據,也是疫情處置措施判定的重要標準[1-2]。有研究在各機構實驗室開展新型冠狀病毒核酸檢測過程中發現,由陽性標本、質控品及擴增產物造成的實驗室環境污染、標本污染易導致假陽性的檢測結果,從而造成防控措施過度、人員恐慌及對核酸檢測結果不可信等問題[3-5]。

針對因人員操作不當、質控品管理不到位等原因造成的陽性標本、質控品及擴增產物污染可通過加強操作人員培訓、規范質控品管理、實施實驗室風險評估及管理等方式來避免假陽性結果的出現[6-7]。而在加樣和核酸提取過程中,因移液吸頭外壁攜帶污染以及核酸提取儀高速震蕩形成的氣溶膠污染引起的假陽性則很難避免[6,8-9]。這種情況通常發生在相鄰孔為強陽性標本或質控品時,會造成初篩結果為陽性而復檢結果為陰性,從而需要進行復檢或重新采樣檢測[10],很大程度上增加了檢測工作量。

為快速、直觀地顯示初篩結果中可能為孔間交叉污染的孔位,便于及時復檢,同時減少不必要的第2次復檢。本研究基于“掃雷游戲”模式,根據聚合酶鏈反應(PCR)擴增原理設置判斷規則,用Excel表格模擬設計PCR反應板,直觀顯示實時檢測結果及可能存在污染的孔位,以方便后續復檢及結果判斷。

1 資料與方法

1.1一般資料 從上海宏石實時熒光定量PCR儀中導出2022年11月29日隔離點送檢的、檢測編號為027B檢測板的新型冠狀病毒核酸檢測原始數據,共計90例標本、3個陰性對照、2個空白對照及1個弱陽性對照的檢測結果。

1.2方法

1.2.1檢測規則 新型冠狀病毒核酸檢測的初篩試劑選用上海思路迪生物醫學科技有限公司試劑;第1次和(或)第2次復檢則采用“初篩試劑+湖南圣湘生物科技有限公司試劑”的雙試劑復檢模式。

1.2.2基于“掃雷游戲”的評估規則 12×8的核酸提取深孔板,除周邊及四角孔位的相鄰孔位較少(3～5個)外,其余孔位均可能受到周邊8個孔位的加樣攜帶污染和提取儀震蕩帶來的氣溶膠污染。因此,如果該孔位檢測結果為陽性,則可能是源于周邊8個孔位中強陽性標本的污染。

1.2.3被污染孔的循環數(Ct)值-污染源孔Ct值≥5的標準設定 按照PCR擴增原理,當擴增效率為100%時,檢測結果間相差n個Ct值即代表標本待測模板間存在2n倍差異。為了最大限度地標識出可能被污染的孔位,假設加樣200 μL的標本可能導致相鄰孔位累計最大量6.25 μL的攜帶污染或氣溶膠污染。此時,陰性標本可能被污染,其病毒含量約為污染源孔的1/32[6.25/(200.00-6.25)],則被污染孔的Ct值-污染源孔Ct值=5。因此,為找出所有可能被相鄰孔污染的孔位,可設定“被污染孔的Ct值-污染源孔Ct值≥5”的條件來識別被污染孔。

1.2.4Excel2021直觀標識可能被污染孔位 用Excel2021模擬設計2塊PCR反應板(孔位號按照逐列排序的方式賦號),其中1塊從原始數據中提取ORF1ab及N基因兩個靶標的檢測值,并按照擴增區12×8的模式對應顯示反應孔的Ct值(2個靶標均無Ct值時不顯示)。另一塊板的每個單元格輸入函數“IF(AND(MIN(OFFSET(Sheet4!B3,-1,-1,3,3))<=41,MIN(OFFSET(Sheet4!B14,-1,-1,3,3))<=41,Sheet4!B3-MIN(OFFSET(Sheet4!B3,-1,-1,3,3))>5,Sheet4!B14-MIN(OFFSET(Sheet4!B14,-1,-1,3,3))>5,Sheet4!B3<=41,Sheet4!B14<=41,OR(Sheet4!B3<>41,Sheet4!B14<>41)),(ROW()-2)+(COLUMN()-16)*8&"號位可能污染","")”,調用Sheet4中各反應孔的ORF1ab和N基因的檢測值進行運算:當該孔位檢測為陽性(即ORF1ab或N基因有Ct值)時,分別用該孔的ORF1ab和N基因的Ct值減去周邊8個相鄰孔位中ORF1ab和N基因最小的Ct值,當兩個計算結果均≥5時,標識該孔位可能被污染。為方便計算,無Ct值的靶標默認其Ct值為最大擴增Ct(41)。見圖1。

注:A用于顯示各反應孔ORF1ab和N基因的Ct值;B用于顯示可能污染的孔位基因;O代表ORF1ab基因;N代表N基因;0表示還未統計Ct值。

1.2.5測試表格的適用性 選取強陽性結果多、易出現孔間污染的隔離點標本的核酸檢測結果,輸入表格,對表格中顯示為可能污染的標本進行雙試劑復核及2次復核,評估表格的適用性。

2 結 果

2.1設計表格可直觀顯示擴增結果及標識可能被污染的孔位 輸入隔離點027B檢測板的新型冠狀病毒核酸檢測數據,圖2A在相應孔位顯示了陽性孔的ORF1ab和N基因的Ct值,同時圖2B標識B11為“82號位可能污染”。分析可知,B11孔可能源于A12孔污染,B11孔與A12孔兩個靶標的Ct值差值為ORF1ab基因7.36(26.14-18.78)、N基因7.39(23.22-15.83),Ct值差值均>5,因此B11孔可能被污染;D2孔與E3孔相鄰,但其ORF1ab基因的Ct值差值為0.62(30.77-30.15)、N基因的Ct值差值為2.93(29.15-26.22),均<5,因此排除污染的可能。見圖2。

注:A為檢測板中所有陽性孔位的ORF1ab和N基因的Ct值;B為檢測板中被判為可能污染的孔位。

2.2初篩陽性孔2次新型冠狀病毒核酸復檢證實表格的適用性 對027B檢測板上所有初篩為陽性的標本進行雙試劑第1次和第2次復檢,結果顯示,B11孔位2次復檢結果均為陰性,D2孔位2次復檢均為陽性,證明該表格適用于實際工作中新型冠狀病毒核酸檢測的結果分析,能快速、直觀地顯示可能存在的污染孔位。見表1。

表1 隔離點標本027B檢測板初篩陽性孔2次復檢結果(Ct值)

3 討 論

目前,醫療機構臨床實驗室開展新型冠狀病毒核酸檢測所采用的方法以反轉錄實時熒光定量PCR法為主[11],但該方法對加樣環境和檢驗人員要求較高,且容易造成孔間交叉污染,導致假陽性檢測結果[12]。由于孔間交叉污染多源于加樣和核酸提取過程中的攜帶污染和氣溶膠污染[13-14],具有偶發性,很難通過實驗室質量控制和風險管理進行規避,只能通過實時分析檢測結果和多次復檢進行評判。

本研究通過Excel軟件模擬設計PCR反應板的布局,直觀地顯示各反應孔與其相鄰孔位的位置關系,并設置“當陽性孔與其周邊最強陽性孔的雙靶標Ct值相差≥5時,判定該孔為可能污染”的標準,可準確地標識可能存在污染的孔位。

當下,由于全國各地疫情防控政策的優化,陸續取消了大規模、集中化的社會面核酸篩查,檢測機構減少可能引起醫療機構實驗室未來一段時間內檢出率的增加。結合該表格的使用,檢驗人員可快速找出可能為交叉污染的標本、及時進行復檢。一方面減少了2次復檢的程序,縮短報告發放時間;另一方面避免了假陽性結果的發出。此外,針對定點治療醫院或方艙醫院等陽性標本較集中的機構,當初檢、復檢結果不一致時,會啟動2次復檢的流程[10],極大地增加了檢測的工作量。此時,將該表格用于分析各陽性孔是否被污染,可以避免非必要的2次復檢,減少核酸檢測工作量。

本研究判定污染的標準為“被污染孔的Ct值-污染源孔Ct值≥5”,是基于檢測試劑盒擴增效率為100%、200 μL加樣量可能攜帶或造成相鄰孔累計6.25 μL污染的假設。實際工作中,很多新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒的擴增效率≤90%[15],吸頭攜帶或氣溶膠污染量可能低于6.25 μL,因此,Ct值差值≥5的標準可根據各實驗室檢測對象、檢出率等因素進行適當調整。

綜上所述,基于“掃雷游戲”原理評估新型冠狀病毒核酸檢測中的孔間污染,可準確、快速預測可能存在污染的孔位,避免多次復檢,減少核酸檢測工作量。