外泌體在顱腦損傷中的研究進展*

張 露,尹麗明,付文金 綜述,陳甘海 審校

東莞市厚街醫院:1.檢驗科;2.重癥醫學科,廣東東莞 523000

顱腦損傷(TBI)是導致死亡和后天致殘的主要原因之一。由于TBI的醫療成本高,給患者及家庭乃至社會都帶來極大的經濟負擔。TBI是指外部機械力對腦實質造成的損傷,包括原發性損傷和繼發性損傷。原發性損傷即在最初的沖擊之下立即引起組織變形、剪切應力變化和周圍血管的損傷,隨后破壞血腦屏障同時伴隨神經元、神經膠質細胞和內皮細胞凋亡,導致組織損傷、水腫、炎癥和神經功能障礙等繼發性損傷[1]。

目前,普遍采用格拉斯哥昏迷指數(GCS)評估患者損傷嚴重程度,然而神經癥狀可能會在整個TBI過程中持續存在,從而降低GCS的準確率。影像學技術如計算機斷層掃描(CT)、磁共振(MRI)盡管應用廣泛,但也存在明顯異質性,即影像學結果相似,但患者預后差異較大。臨床指南中關于TBI診斷和預測預后可使用的生物標志物有限。有研究表明,外泌體可在腦組織內發出短程和遠程信號,通過腦脊液循環將信號傳達至整個大腦,從而調控多種神經系統疾病[2]。深入研究外泌體在繼發性TBI中發揮的作用可以為TBI的診斷及治療提供新的途徑。

1 外泌體的產生與基本生物學特性

外泌體是由細胞內溶酶體內陷形成多囊泡體,當多囊泡體再次與質膜融合,釋放到細胞外直徑在30～120 nm的脂質囊泡。在研究綿羊網織紅細胞發育為成熟紅細胞的機制時外泌體首次被發現,并于1987年被正式命名。起初,外泌體和血小板一樣,被認為是細胞釋放的“垃圾”,隨著研究的深入,學者們發現大多數細胞均可分泌外泌體,且外泌體廣泛存在于各種體液中。其特征性的蛋白包括跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81)、膜轉運蛋白(Rab-GTPase)及熱休克蛋白(HSP60、HSP70)等。外泌體富含蛋白質、脂質、DNA、信使RNA、微小RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA等信號分子,通過直接融合、內吞作用、特異性受體結合,將所包含的信息傳遞到靶細胞,從而調節多種生理和病理過程,在細胞通信中發揮著重要的作用。

2 TBI的繼發性損傷機制

2.1血腦屏障損傷導致腦水腫 有研究發現,TBI急性期會出現廣泛的血腦屏障破壞,可持續存在數十年[3-4]。血腦屏障功能障礙導致其通透性增加,大分子物質和血清蛋白的轉運增加[5-6]。而清蛋白外滲導致星形膠質細胞釋放的基質金屬蛋白酶(MMP)降解基底膜,進一步提高了血腦屏障的通透性,從而引起腦水腫[7]。腦血管周圍積液累積可導致腦血流量變化和顱內壓升高,若不及時控制該變化可導致不可逆的組織損傷和細胞死亡,這是導致重型TBI患者的高病死率的原因之一[8-9]。

2.2神經炎癥與氧化應激反應導致神經退行性變與神經細胞死亡 早期炎癥反應發揮著保護神經系統及修復受損細胞的作用。當巨噬細胞和小膠質細胞在大腦中長期處于激活狀態時,一方面釋放炎癥因子誘導整合素聚集,招募淋巴細胞到損傷部位,與神經元細胞、促炎癥細胞因子共同參與了炎癥反應[10];另一方面介導主要組織相容性復合體Ⅱ的表達上調,導致神經退行性變。此外,TBI發生后谷氨酸釋放增加,誘導神經元去極化,引起Ca2+內流,線粒體受損,導致毒性活性氧(ROS)生成增加。ROS消耗細胞內的抗氧化劑,進一步破壞細胞和細胞器,從而介導其他繼發性細胞死亡機制(凋亡或壞死)[11]。因此,炎癥反應和ROS生成被認為是TBI急性期后最重要的繼發性損傷過程。

3 外泌體可雙向調控繼發性TBI

外泌體在TBI后24 h釋放增加[12]。CHEN等[13]在大鼠創傷性腦損傷模型中進一步證實了該結論,其還發現,TBI后外泌體釋放增加依賴于縫隙連接蛋白43的磷酸化。

3.1外泌體促進繼發性TBI 外泌體在調節血腦屏障完整性中發揮著重要作用。經白細胞介素(IL)-1β刺激的巨噬細胞可分泌外泌體miR-21,激活了核因子(NF)-κB的信號通路及誘導MMP-1、MMP-3和MMP-9的釋放,降解了細胞緊密連接蛋白(TJPs),進而破壞血腦屏障通透性及促進神經炎癥,導致神經細胞凋亡。進一步研究發現,人參皂苷Rg1可以抑制外周血中外泌體miR-21進入大腦,促進MMP蛋白水解,限制TJPs降解,從而保護血腦屏障完整性[14]。這提示巨噬細胞來源的外泌體通過破壞血腦屏障完整性加重了TBI反應,而人參皂苷Rg1可抑制外泌體miR-21釋放改善腦血管內皮損傷從而減弱TBI反應。

小膠質細胞來源的外泌體可促進神經炎癥反應。小膠質細胞來源的微囊泡在TBI后24 h內釋放增加(P<0.05)[15]。將這些攜帶著miR-155、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1等促炎分子的微囊泡注射到未受傷的小鼠體內后,未受傷的小鼠體內也出現了創傷后神經炎癥表現(P<0.05)[15],提示小膠質細胞來源的微囊泡通過傳遞神經炎癥反應介導繼發性TBI,而有效抑制微囊泡的產生則是治療TBI潛在的靶點。

3.2外泌體抑制繼發性TBI 星形膠質細胞來源的外泌體可保護海馬神經元。星形膠質細胞是人腦中數量最多的神經膠質細胞,其數量是神經元的5倍,在調節血流量、維持血腦屏障穩定、為神經組織提供代謝支持及各種損傷后的腦修復中發揮著不可或缺的作用[16]。miR-873a-5p是活化后星形膠質細胞來源的外泌體的主要成分之一。LONG等[17]發現,miR-873a-5p通過降低細胞外調節蛋白激酶ERK和NF-κB p65的磷酸化顯著抑制脂多糖誘導的小膠質細胞M1表型轉化和隨后的炎癥反應(P<0.01)。另有研究發現,TBI發生后星形膠質細胞來源的外泌體(AS-exosomes)通過抑制線粒體氧化應激反應及神經元凋亡發揮保護海馬神經元的作用[18]。可能的原因是AS-exosomes通過激活TBI動物模型中的Nrf2/HO-1信號傳導,增強了海馬神經元中的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等抗氧化酶的活性,顯著降低了氧化應激和線粒體H2O2水平,從而改善細胞氧化應激狀態,抑制神經元萎縮與凋亡,有效地緩解了神經行為缺陷、認知障礙和腦水腫等癥狀。反之,敲除了TBI小鼠大腦中特異性Nrf2后,AS-exosomes的神經保護作用也隨之消失。

間充質干細胞來源的外泌體抑制炎癥反應。有研究表明,間充質干細胞來源的外泌體通過提高IL-10的表達并降低NF-κB、IL-6、IL-1的水平,活化M2型小膠質細胞抑制炎癥反應[19]。CHEN等[20]為了確定人脂肪間充質干細胞外泌體(hADSC-exosomes)對TBI誘導的神經元凋亡、小膠質細胞/巨噬細胞持續激活及海馬神經再生的影響,檢測TBI后炎癥因子水平、病變邊界區域的凋亡神經元數量,以及腦冠狀切面處新生成的神經元。與對照組比較,hADSC-exosomes組炎癥因子水平與神經細胞凋亡率均更低(P<0.01),病灶邊界區激活的小膠質細胞/巨噬細胞明顯減少(P<0.01),而海馬齒狀回新生神經元數量明顯增多(P<0.05)。這表明hADSC-exosomes能抑制TBI后急性炎癥細胞因子的產生,抑制慢性小膠質細胞/巨噬細胞的活化,減少神經元凋亡。

總之,不同來源的外泌體通過多種不同的途徑來調控血腦屏障的完整性、抑制神經系統炎癥反應等,從而緩解TBI的繼發性損傷。因此,星形膠質細胞和間充質干細胞來源的外泌體可作為評估TBI嚴重程度及預后的生物標志物。

4 外泌體在TBI診斷與治療中的研究進展

4.1TBI診斷的方法學比較 目前,對TBI的診斷主要通過詢問病史、神經系統檢查和影像學方法。CT作為診斷TBI的首選方法,可以準確診斷顱內病變且靈敏度高,在評估患者預后方面也有較好的效能[21]。但其檢測存在不足,比如出現彌漫性腦損傷時,則需要MRI進一步診斷。且由于動態增強CT使用碘造影劑,可能會導致不良反應[22]。MRI是一種敏感、無創的方法,通過評價高強度急性再灌注標志物判斷血腦屏障的功能完整性,但是MRI價格昂貴、耗時、需要造影劑、存在部分禁忌證。

檢驗技術的發展逐步彌補了現有TBI診斷技術的不足。大量研究證實,外泌體在TBI的診斷[23]及治療(基因和藥物輸送)[24-25]中具有優勢。一方面外泌體是一種靈敏度高和特異度均較高的生物標志物,循環半衰期長,易于在體液中檢測(外泌體在TBI后24 h釋放增加),具有取樣無創、含量豐富、可動態監測疾病等特點;另一方面外泌體具有直徑小,免疫原性低,可避免被內皮網狀系統吞噬,其脂質結構使其可透過血腦屏障的特點[26],可作為藥物載體進入中樞神經系統。

4.2外泌體在TBI輔助診斷中的研究 有研究表明,外泌體可作為診斷TBI的標志物,在TBI后的急性期,活化的小膠質細胞會釋放外泌體介導神經元死亡,阻礙神經突生長和突觸恢復[27]。ZYA等[28]發現,TBI后神經元和小膠質細胞中miR-21-5p水平升高。接著通過共培養PC12細胞和BV2細胞模擬神經元和小膠質細胞在體內環境中的相互作用,進一步發現PC12來源的外泌體miR-21-5p被小膠質細胞吞噬并誘導小膠質細胞極化。M1型小膠質細胞極化促進神經炎癥因子的釋放,抑制神經突生長,使磷酸化的微管蛋白P-tau積累。而該蛋白反過來促進PC12細胞凋亡,提示外泌體miR-21-5p通過調控炎癥反應促進了TBI發展,可作為生物標志物輔助評估TBI的嚴重程度。

4.3外泌體在TBI治療中的研究 外泌體在神經系統疾病治療中具有潛在的應用價值。SHARMA等[29]將健康的DIV9嚙齒動物的原代神經培養物中獲得的外泌體注射到P4小鼠的側腦室中,觀察到小鼠神經元,特別是齒狀回區域(該區域與小鼠的學習和記憶有關)增殖增加。此外,該研究還顯示,外泌體能夠逆轉X連鎖甲基-CpG結合蛋白2突變體神經元中觀察到的一些病理表型。M2型小膠質細胞分泌的外泌體可轉運miR-124至神經元細胞,靶向負調控去泛素化酶14從而減輕缺血性腦損傷并減少神經元凋亡。提示M2型小膠質細胞來源的外泌體可能是治療缺血性腦卒中的潛在治療靶點[30]。另有研究發現,早期單劑量間充質干細胞MSC-exosomes給藥可改善血腦屏障完整性[31]。其可能的原因是MSC-exosomes給藥組動物腦腫脹明顯減輕,病灶體積更小,顱內壓降低和腦灌注壓增加。此外,MSC-exosomes給藥組動物清蛋白外滲減少,血清膠質纖維酸性蛋白水平顯著降低(P<0.05),而層黏連蛋白、緊密連接蛋白5、胞質緊密黏連蛋白水平顯著升高(P<0.05)[31]。總之,這些研究結果證實小膠質細胞和間充質干細胞等來源的外泌體對神經系統起保護作用,是TBI潛在的治療靶點,也是監測療效的標志物。

5 小 結

盡管對TBI的病理生理學認識進展迅速,但由于中、重度創傷性TBI患者仍存在長期的神經功能缺損,對TBI的診斷主要依賴于自我認知報告、主觀癥狀和影像學檢查,這些方法均有各自的局限性。外泌體作為一種新型生物標志物廣泛存在于各種體液中,如尿液、血液、血清、母乳、羊水、腦脊液等,其脂質結構使其具有透過生物屏障的能力,且參與了多種神經系統疾病發生、發展過程。

雖然已有大量細胞實驗[28]和動物實驗[27,29-31]證實外泌體可作為評估TBI嚴重程度的標志物及治療靶點,但缺乏相關的臨床研究,基礎研究向臨床研究的轉化還面臨諸多挑戰。首先,目前對外泌體的具體合成機制、功能了解并不是十分清楚;其次,幾乎所有細胞均能分泌外泌體,且外泌體的釋放還受到各種刺激甚至是生活習慣的影響。那么如何提高外泌體診斷疾病的靈敏度和特異度是必須要解決的問題;再次,現在缺乏經濟、有效的外泌體分離技術,外泌體的提取沒有建立統一的規范化操作且外泌體的提取成本較高,因此,不適合在臨床大規模使用;最后,要實現外泌體的臨床治療,還需突破外泌體的藥物遞送系統的技術以及大量臨床試驗的數據支持。