江蘇宿遷地區長鏈非編碼RNA H19基因多態性與胃癌易感性的關聯分析*

邱 巍,陳素梅,劉東聲

徐州醫科大學附屬宿遷醫院檢驗科/江蘇省宿遷市檢驗醫學重點實驗室,江蘇宿遷 223800

胃癌在全球各種惡性腫瘤中的發病率位于第6位、病死率位于第3位[1]。在我國各種惡性腫瘤中其發病率位居首位、病死率位居第2位。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是由RNA聚合酶Ⅱ轉錄而來,是一種不能編碼蛋白質、長度超過200 bp的RNA,在組織和細胞中表現出較強的特異性[2]。LncRNA H19最早被發現位于人類染色體11p15.5上,包含5個外顯子和4個內含子,其第5個外顯子上的Rsal多態酶切位點可以與胰島素樣生長因子2(IGF-2)組成H19/IGF-2印記基因群[3]。LncRNA H19在胚胎發育時期表達水平較高,但出生后在大部分組織器官內的表達水平都顯著下降[4]。LncRNA H19在不同的惡性腫瘤中發揮著作用,在部分腫瘤中有著促癌作用,如肝癌[5]、腎癌[6]、乳腺癌[7]等。本研究采用限制性片段長度多態性PCR技術分析了LncRNA H19 在rs217727 C>T和rs2839698 C>T位點的基因型頻率分布與胃癌的易感性,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月至2021年12月本院收治的胃癌患者265例作為胃癌組,同期健康體檢者284例作為對照組。胃癌組納入標準:符合中華人民共和國衛生行業標準胃癌診斷標準[8];經組織病理學檢查確診為胃癌;術前未經放、化療。排除標準:患有其他類型腫瘤。對照組納入標準:經過病史詢問和實驗室檢查排除心腦血管疾病、糖尿病、腫瘤、消化系統疾病及其他全身性疾病。兩組人群均為宿遷地區漢族人群,年齡、性別比例相匹配且個體之間均無血緣關系。胃癌組平均年齡(65.40±11.38)歲,男192例,女73例;對照組平均年齡(64.71±4.74)歲,男222例,女62例。兩組一般資料比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。胃癌組年齡<60歲患者68例,≥60歲患者197例。對照組年齡<60歲患者59例,≥60歲患者225例。本研究經醫院醫學倫理委員會批準,所有研究對象均知情同意。

1.2儀器與試劑 Eppendorf 5424R離心機為德國艾本德公司生產,Bio-Rad T100 PCR儀為美國伯樂公司生產,DYY-8C型電泳儀為北京六一儀器廠生產,FR-980A生物電泳圖像分析系統為上海復日科技有限公司生產,752紫外可見分光光度計為上海佑科儀器儀表有限公司生產,血液基因組DNA提取試劑盒為北京天根生化科技公司生產,PCR試劑盒為大連寶生物工程有限公司生產,酶切試劑盒為美國紐英倫生物技術有限公司生產。

1.3方法

1.3.1基因組DNA提取 采集兩組研究對象空腹狀態下5 mL EDTA-K2抗凝的全血。采用血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA,使用紫外分光光度計檢測DNA水平和純度。將提取的基因組DNA溶解于TE緩沖液中,置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2引物設計 LncRNA H19在rs217727 C>T和rs2839698 C>T位點引物設計參照文獻[9]。rs217727 C>T上游引物序列:5′-GTCGCTATCTCTAGGTGAAG-3′;下游引物序列:5′-GTGGAGGCTTTGAATCTCTC-3′;產物片段大小為291 bp。rs2839698 C>T上游引物序列:5′-AAGGAGCACCTTGGACATCT-3′;下游引物序列:5′-CTGCCACGTCCTGTAACCAA-3′;產物片段大小為226 bp。

1.3.3PCR反應 使用Takara PCR試劑盒,25.0 μL反應體系:5 U/μL Ex Taq 0.2 μL,10×buffer(Mg2+free)2.5 μL,25 mmol/L MgCl22.0 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL,10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL,DNA模板2.0 μL,ddH2O補足體積。rs217727 C>T位點的循環參數:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,64 ℃ 40 s,72 ℃ 45 s,共40個循環;72 ℃ 10 min。rs2839698 C>T位點的循環參數:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,63 ℃ 40 s,72 ℃ 45 s,共40個循環;72 ℃ 10 min。

1.3.4酶切反應 使用NEB酶切試劑盒,rs217727 C>T位點的20 μL酶切體系:PCR產物5 μL,EciⅠ1 μL,10×NEBuffer 5 μL,ddH2O 9 μL,37 ℃酶切1 h。rs2839698 C>T位點的20 μL酶切體系為PCR產物5 μL,KasⅠ 1 μL,10× NE Buffer 5 μL,ddH2O 9 μL,37 ℃酶切1 h。使用3%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產物。

2 結 果

2.1基因分型結果 在rs217727 C>T位點,PCR產物經EciⅠ酶切后TT基因型為291 bp的1條片段;CT基因型為145、146、291 bp的3條片段;CC型為145、146 bp的2條片段。在rs2839698 C>T位點,PCR產物經KasⅠ酶切后TT基因型為226 bp的1條片段;CT基因型為106、120、226 bp的3條片段;CC基因型為106、120 bp的2條片段。

2.2兩組基因多態性分布比較 經Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗,rs217727 C>T位點在胃癌組(χ2=0.09,P=0.762)和對照組(χ2=0.62,P=0.430),rs2839698 C>T位點在胃癌組(χ2=2.62,P=0.106)和對照組(χ2=0.63,P=0.427)中基因型分布均符合遺傳平衡定律。

經Logistic回歸校正年齡、性別后胃癌組和對照組rs217727 C>T位點CC基因型與TT基因型頻率比較,差異有統計學意義(χ2=6.33,P<0.05),與CC比較,TT純合子發生胃癌的風險是其1.93倍(OR=1.93,95%CI=1.15～3.25);CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=1.97,P>0.05);CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=2.46,P>0.05);胃癌組T等位基因頻率高于對照組,差異有統計學意義(χ2=6.15,P<0.05)。兩組rs2839698 C>T位點CC基因型與TT基因型頻率比較,差異有統計學意義(χ2=4.49,P<0.05),與CC比較,TT純合子發生胃癌的風險是其1.91倍(OR=1.91,95%CI=1.04～3.51); CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=1.82,P>0.05);CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=1.82,P>0.05);胃癌組T等位基因頻率高于對照組,差異有統計學意義(χ2=5.12,P<0.05)。見表1、2。

表1 兩組rs217727 C>T位點基因型與等位基因頻率比較[n(%)]

表2 兩組rs2839698 C>T位點基因型與等位基因頻率比較[n(%)]

2.3年齡、性別與基因型頻率的關系 將胃癌組和對照組分別按年齡分層后發現:兩組間rs217727 C>T位點在年齡<60歲研究對象中CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=0.58,P>0.05);CC基因型與TT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=2.11,P>0.05);CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=0.90,P>0.05)。在年齡≥60歲研究對象中CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=1.29,P>0.05);CC基因型與TT基因型頻率比較,差異有統計學意義(χ2=3.95,P<0.05);CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=1.50,P>0.05)。兩組間男性CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=1.63,P>0.05),CC基因型與TT基因型頻率比較,差異有統計學意義(χ2=4.95,P<0.05);CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=1.83,P>0.05)。女性CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=0.15,P>0.05);CC基因型與TT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=1.27,P>0.05);CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=0.82,P>0.05)。見表3、4。

表3 兩組rs217727 C>T位點年齡與基因型頻率的關系[n(%)]

表4 兩組rs217727 C>T位點性別與基因型頻率的關系[n(%)]

在rs2839698 C>T位點:年齡<60歲研究對象中CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=0.61,P>0.05);CC基因型與TT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=1.05,P>0.05);CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=0.24,P>0.05)。在年齡≥60歲研究對象中CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=0.73,P>0.05);CC基因型與TT基因型頻率比較,差異有統計學意義(χ2=4.42,P<0.05); CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=2.37,P>0.05)。兩組間男性CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=1.31,P>0.05);CC基因型與TT基因型頻率比較,差異有統計學意義(χ2=4.27,P<0.05);CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=1.80,P>0.05)。女性CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=0.12,P>0.05);CC基因型與TT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=1.19,P>0.05);CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統計學意義(χ2=0.67,P>0.05)。見表5、6。

表5 兩組rs2839698 C>T位點年齡與基因型頻率的關系[n(%)]

表6 兩組rs2839698 C>T位點性別與基因型頻率的關系[n(%)]

3 討 論

隨著研究的深入,大量研究表明,LncRNA與腫瘤的發生、發展密切相關,其參與了基因印記、染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種重要的過程[10-11],從而調控了腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲等生物學行為[12-14]。LncRNA H19通過不同的調節機制在不同類型的腫瘤中發揮促癌作用。單核苷酸多態性(SNP)是人類最常見的遺傳變異,主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異引起的DNA序列的改變。有研究發現,LncRNA上的功能性SNP位點可能通過轉錄調控影響LncRNA的表達,從而在腫瘤的發生、發展過程中起重要作用[15]。

在本研究中,LncRNA H19 rs217727 C>T位點在胃癌組的等位基因T頻率為0.440,顯著高于對照組的0.366(χ2=6.15,P<0.05);rs2839698 C>T位點在胃癌組的等位基因T頻率為0.309,顯著高于對照組的0.248(χ2=5.12,P<0.05)。兩個位點中胃癌組和對照組TT基因型與CC基因型頻率比較,差異均有統計學意義(P<0.05),與CC比較, rs217727 C>T位點TT純合子有1.93倍的胃癌風險(OR=1.93,95%CI=1.15～3.25),rs2839698 C>T位點TT純合子有1.91倍的胃癌風險(OR=1.91,95%CI=1.04～3.51),說明rs217727 C>T和2839698 C>T位點中的突變T等位基因可能是胃癌的危險因素。兩個位點在年齡≥60歲男性中CC基因型與TT基因型頻率比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。這表明在rs217727 C>T和rs2839698 C>T位點中的基因型變異使發生胃癌的風險增加,在年齡≥60歲的男性中更為顯著。這可能與累積暴露于存在致癌物的環境中及老年人的免疫系統較弱相關。YANG等[16]關于中國漢族人群LncRNA H19多態性與胃癌相關性的研究結果顯示,在rs217727和rs2839698位點中的基因型變異在<59歲的人群中更為顯著。這一結論與本研究結果相反,還需要進一步的研究來驗證。PEI等[9]在對LncRNA H19的遺傳變異與中國臺灣地區兒童白血病的易感性研究中發現, SNP rs2839698位點與兒童白血病有關聯性,而rs217727位點則無相關性。LI等[17]在LncRNA H19遺傳變異與中國人群結直腸癌風險的關系研究中報道,rs2839698位點與結直腸癌風險升高有關,rs3024270、rs217727和rs2735971位點與結直腸癌風險無關。TAN等[18]在LncRNA H19多態性與中國人群肝母細胞瘤風險的相關性研究中報道,rs2839698、rs3024270和rs217727基因多態性與中國漢族人群肝母細胞瘤易感性相關。LncRNA H19基因多態性與腫瘤的遺傳易感性研究結論不盡相同,這可能與研究對象的樣本量、代表性和遺傳背景有關。腫瘤的發生涉及多個基因的變異,研究單個基因的SNP往往存在一定的局限性。