不同抽提方式在流行性感冒病毒檢測中的抽提效率研究*

張相猛,周志豪,潘俊鋒,徐秋芳

上海市青浦區疾病預防控制中心微生物檢驗科,上海 201700

流行性感冒(流感)病毒以呼吸道為入侵門戶,在呼吸道黏膜上皮細胞中增殖,引起呼吸道局部感染或導致呼吸道以外組織器官病變。作為最常見的呼吸道病毒,流感病毒的肆虐每年造成巨大的經濟損失。目前,至少還有200多種病毒可以引起呼吸道感染,如呼吸道合胞病毒、冠狀病毒等[1-2]。新型冠狀病毒感染疫情是由新型冠狀病毒引起的全球應急事件。流感病毒實驗室常規檢測方法為實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR),其具有靈敏度高,特異性強的優勢[3]。但是在實驗室檢測過程中多種因素可導致假陰性結果,尤其是在對弱陽性標本進行檢測時更為明顯。

其中核酸抽提是病毒核酸檢測的重要環節,核酸抽提結果直接影響核酸檢測的靈敏度和特異度[4]。傳統的核酸抽提方法為沉淀離心手工抽提法,手工抽提對實驗人員操作要求較高,且耗時較長。隨著磁珠分離技術在生物科學領域不斷普及和廣泛應用,該技術逐步用于核酸自動抽提,不僅大大提高了核酸抽提的效率,還減少了人工操作的誤差[5-6]。其原理為特殊包被的磁珠對樣品中的核酸具有很強的吸附力,從而達到抽提、純化標本中核酸的效果[7-8]。為了進一步提高檢測效率,一些生物公司研制的全自動核酸抽提儀推出了快速抽提和普通抽提兩種模式。二者的主要差異在于組分和結合時間不同[9],快速抽提法所需時間較普通抽提法短,但是抽提時間及程序的不同會影響到核酸檢測的質量,出現漏檢情況,從而影響對疫情的早期研判、導致疫情擴散。

1 材料與方法

1.1菌株來源 選取本中心核酸檢測陽性流感患者臨床標本分離到的乙型流感病毒Victoria型毒株作為研究對象。

1.2儀器與試劑 全自動核酸抽提儀(江蘇碩世科技股份有限公司)、Light Cycle 480Ⅱ實時熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)。乙型流感病毒Victoria型核酸檢測試劑盒(熒光PCR法,上海之江生物科技股份有限公司,批號:20220403),核酸快速抽提試劑盒(磁珠法,碩世生物科技股份有限公司,批號:202205174),核酸普通抽提試劑盒(磁珠法,碩世生物科技股份有限公司,批號:20220276)。

1.3方法

1.3.1菌株處理 將流感病毒毒株高速離心去除雜質后留取上清液,將上清液按照1∶10、1∶100倍比稀釋至1∶109。

1.3.2核酸抽提 采用同一臺核酸抽提儀按以下步驟對標本進行核酸抽提。快速抽提法參數設定為90 ℃裂解0 s,磁珠重懸10 s,結合400 s,洗滌30 s,90 ℃洗脫120 s,棄磁珠。普通抽提法參數設定為90 ℃裂解5 min,磁珠重懸1 min,結合10 min,洗滌8 min,90 ℃洗脫3 min,棄磁珠。

1.3.3核酸檢測 采用全自動核酸檢測儀對抽提后的核酸進行核酸檢測,按照乙型流感病毒Victoria型核酸檢測試劑盒要求配制好核酸檢測體系。加樣后置于Light Cycle 480Ⅱ實時熒光定量PCR儀,參數設定為45 ℃、10 min,95 ℃、15 min,95 ℃、15 s,60 ℃、60 s,循環次數設定為40次。在60 ℃時進行熒光檢測,檢測通道為FAM通道。

1.3.4結果判定 靶標檢測結果判定標準:擴增曲線不呈S型,Ct值>39或Ct值空白為陰性;擴增曲線呈S型,且Ct值≤39為陽性。

1.4觀察指標

1.4.1檢出率 采用兩種抽提方法將各稀釋倍數標本平行檢測4次,實時熒光定量PCR檢測后Ct值≤39為檢出病毒基因,比較各稀釋倍數下不同抽提方法平行檢測的檢出率。

1.4.3線性 以稀釋倍數的對數為橫坐標,各稀釋倍數平行檢測4次Ct值均值為縱坐標,比較兩種方法稀釋倍數與Ct值的線性關系。

2 結 果

2.1兩種抽提方法檢測結果 采用兩種方法對各稀釋倍數標本進行平行核酸抽提后,經實時熒光定量PCR檢測,結果顯示快速抽提法在原液至106稀釋倍數均能檢出,稀釋至107倍后4次平行檢測檢出率為50%,稀釋至108倍后不再檢出。普通抽提法在原液至107稀釋倍數均能檢出,稀釋至108倍后4次平行檢測檢出率為75%,稀釋至109倍后不再檢出。兩種方法在不同稀釋倍數的檢出率比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩種抽提方法不同稀釋倍數檢測的Ct值

2.2兩種抽提方法重復性比較 對標本平行檢測4次,核酸抽提后各稀釋倍數實時熒光定量PCR檢測結果CV值見表2。結果顯示,不同稀釋倍數下普通抽提法CV值均低于快速抽提法。兩種方法在原液至107稀釋倍數的CV值差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 兩種抽提方法不同稀釋倍數的重復性

2.3兩種抽提方法線性比較 采用兩種方法對各稀釋倍數標本進行核酸抽提后,實時熒光定量PCR檢測結果顯示,不同稀釋倍數下普通提取法Ct值均小于快速提取法,原液至105稀釋倍數下兩種方法Ct值結果差異無統計學意義(P>0.05),106～107稀釋倍數下兩種方法Ct值結果差異有統計學意義(P<0.05)。各稀釋倍數線性關系良好,快速抽提法回歸方程為Y=2.86X+14.42,R2=0.971。普通抽提法回歸方程為Y=2.805X+13.61,R2=0.983。見圖1。

圖1 不同抽提方法的線性關系

3 討 論

自新型冠狀病毒感染疫情暴發以來,在疫情早期處置中,尤其是高致病性呼吸道傳染病疫情處置中要求實驗結果的出具快速、準確。因此一些生物公司推出的快速抽提法核酸抽提試劑盒在普通抽提法的基礎上簡化了流程。快速抽提法較普通抽提法能較大限度減少樣品核酸抽提時間,在疫情處置中發揮重大作用。但是實時熒光定量PCR檢測病毒核酸的靈敏度受多種因素的影響,如核酸模板的質量、引物與探針的特異性[10],這些影響因素中核酸模板的質量極其重要,核酸提取的質量不佳可能會導致病毒載量低的標本出現假陰性結果。核酸抽提條件的改變能影響標本核酸抽提效率[11-13],從而影響實時熒光定量PCR的檢測結果。

病毒的核酸抽提方法目前主要為磁珠法,其操作步驟大致分為裂解、結合和洗脫。與普通抽提法比較,快速抽提法縮短了這3個步驟時間。裂解過程能裂解病毒表面蛋白質,有助于標本充分釋放核酸[14]。結合過程能讓磁珠充分吸附核酸。洗滌液主要用來去除抽提過程中產生的蛋白類抑制物,該物質被帶入核酸檢測的產品中容易導致低濃度的標本檢測不出[15]。本研究結果顯示,去掉或者縮短某些步驟對核酸抽提效率有一定影響。

本研究選取流感病毒進行實驗,結果顯示在檢出率方面,低稀釋倍數(稀釋倍數≤106)標本中兩種方法均能檢出病毒核酸,高稀釋倍數(稀釋倍數≥107)標本或當Ct值接近臨界值時,快速抽提法檢出率較普通抽提法有所下降,且隨著稀釋倍數的增加,兩者之間Ct值差異越大。這提示快速抽提法在病毒含量低的標本中檢出率低于普通抽提法,因此可能會導致陽性標本漏檢。CV值是考查檢測方法重復性的指標[16],本研究中普通抽提法CV值在各個稀釋倍數均明顯低于快速抽提法,顯示在穩定性方面普通抽提法明顯優于快速抽提法。不同稀釋倍數普通抽提法Ct值均小于快速抽提法,且不同稀釋倍數下線性優于快速抽提法,提示普通抽提法抽提效率高于快速抽提法。

病毒性傳染病的篩查工作以“早發現、早診斷、早隔離、早治療”為重點。快速抽提法具有檢測時間短、成本低的優點,能有效節省時間和成本,滿足疫情早期大批量標本檢測的要求。但是在抽提多類型復雜標本或病毒含量較低的標本時,快速抽提法可能導致結果出現假陰性,建議采用抽提純化和抽提效率更有保證的普通抽提法,確保檢測結果的準確性,以避免漏檢,從而導致疫情擴散。

本研究仍存在一定的局限性,由于倍比稀釋對標本濃度要求較高,本研究采用的研究對象是經臨床標本分離培養得到的流感病毒毒株,而日常檢測中血液、鼻咽拭子等標本形式多樣且存在各種雜質,標本具有一定的復雜性,均一性也更差[17]。采用臨床標本開展實驗更貼近實際,也更能對比兩種抽提方法對復雜類型標本的抽提效果。