38例ABO血型抗原表達異常的基因分析*

楊紅梅,陳敏潔,鄒 昕,虞 茜,馬思飛,張建偉

江蘇省常州市中心血站/常州市臨床輸血重點專科實驗室,江蘇常州 213004

ABO血型系統是輸血醫學中最重要的一個血型系統,在臨床輸血、器官移植和產前診斷中具有重要意義[1-2]。正確的血型鑒定是臨床輸血安全的重要保障。在ABO血型血清學鑒定時常常因正反不一致、抗原表達減弱、抗體減弱或消失及混合視野等現象導致定型困難,出現疑似亞型。目前國內對于ABO亞型的研究報道多見于個案[3-6],本研究對38例血清學檢測抗原異常表達的血型標本進行ABO基因第1～7外顯子編碼區測序,探討ABO血型抗原表達減弱的分子機制及常州地區基因多態性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年1月至2021年12月來自常州市各醫療機構及本站檢測中心血清學鑒定正反不一致送輸血研究室進行疑難血型鑒定標本38例,其中獻血者11例(微孔板法),患者27例(凝膠卡法)。血樣于靜脈采集5 mL,4 ℃保存于EDTA抗凝管中。本研究已通過常州市中心血站醫學倫理委員會審查(20230102)。

1.2儀器與試劑 AB公司9700型PCR擴增儀、DNA濃度測定儀、凝膠成像系統、貝克曼高速離心機、久保田KA-2200血清學專用離心機、37 ℃恒溫水浴箱。抗-A/B單克隆抗體(上海血液生物)、抗-D(IgM)單克隆抗體(上海血液生物)、抗-H抗體(德國CE)、抗-AB抗體(德國CE)、抗-A1抗體(上海血液生物)、ABO血型反定型紅細胞(北京金豪)、抗體篩選細胞(匈牙利REAGENS)、ABO-特異性序列引物聚合酶鏈反應(PCR-SSP)基因分型試劑盒(天津秀鵬生物)、DNA提取試劑(Invitrogen)、瓊脂糖(北京沃比森)、溴化乙錠(10 mg/mL,捷世康)。

1.3方法

1.3.1血清學檢測 采用鹽水試管法對38例標本進行ABO血型血清學鑒定。取被檢者和對照A、B、O型獻血者紅細胞少許,生理鹽水洗滌3次,均配制成2%～4%紅細胞生理鹽水懸液進行抗-H、抗-A1和抗-AB試驗,離心判讀凝集強度;同時對標本進行抗體篩查。所有試驗均嚴格按照AABB技術手冊第18版[7]和文獻[8]方法及試劑操作說明書進行。

1.3.2PCR-SSP基因組DNA提取及ABO基因擴增、電泳跑膠后的膠圖比對分析 使用Invitrogen DNA提取試劑盒提取患者外周血基因組DNA,調整DNA模板水平為30～35 ng/μL,A260/A280比值為1.60～1.80,根據人類ABO血型基因檢測試劑盒說明書設置參數進行PCR擴增。取擴增產物于2%瓊脂糖凝膠中電泳跑膠、生成凝膠成像圖譜,與天津秀鵬生物試劑盒提供的圖譜進行比對。

1.3.3ABO基因測序分析和序列比對 ABO基因第6～7外顯子擴增片段大小約為2 019 bp,擴增反應體系參照天津秀鵬生物試劑盒說明書,上游引物為5′-CCTGCCAGCTCCATGTGAC-3′,下游引物為5′-CAGGACGGACAAAGGA-3′。擴增產物經純化后測序第1～7外顯子編碼區,該實驗部分委托天津秀鵬生物完成。第6外顯子測序上游和下游引物為5′-CATGTGGGTGGCACCCTGCC-3′,5′-ATGTCCACAGTCACTCGCCA-3′;第7外顯子上游和下游引物:5′-GCTCCCCCAGCCCCCGTCCG-3′,5′-GTTTACCCGTTCTGCTAA-3′。測序后與NCBI在線數據庫nucleotide blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進行比對,確定其基因型。

2 結 果

2.1血清學檢測結果 對38例標本采用鹽水試管法進行ABO血型鑒定,血清學結果顯示ABO血型抗原表達異常,正反定型結果不符,抗體篩選試驗均為陰性。其中A抗原表達異常14例,B抗原表達異常24例,其中與抗-A或抗-B試劑反應呈混合視野18例,標本紅細胞與抗-H試劑均有不同程度反應,38例標本經血清學鑒定均為ABO亞型,涉及血清學表型包括Bend、cisAB/A、ABx、B(A)、cisAB/O、ABend、AxB、Bx、Bmh、Aend、B3、AB3、A3、Am共14種。對照A、B、O型紅細胞與抗-H、抗-A1和抗-AB反應結果均符合傳統規律。由于38例標本ABO抗原檢測基本上均有明顯凝集,因此沒有再進行紅細胞吸收放散試驗。

2.2分子生物學檢測結果 ABO血型基因第1～7外顯子編碼區測序結果根據ISBT(International Society of Blood Transfusion)網站提供的Names for ABO(ISBT001)blood group alleles v1.1171023綜合結果判定(以ABO*A1.01為參考序列)。38例標本結果分布為7例A亞型、11例B亞型及20例AB亞型。38例標本中共檢出ABO等位基因18個,其中常見的等位基因15個,罕見的等位基因1個(Bw30/O01)及新等位基因2個。常州地區ABO基因多態性主要以A102/B101、A307/O02及Bw03為主,其中A102/B101占18.4%(7/38)、A307/O02占15.8%(6/38)、Bw03占7.9%(3/38)。例1、8、12、13、17因突變未被ISBT網站收錄。見表1和圖1。

注:a為A102(873C>T);b為A102/Bw.03(1036A>C);c為B310/O01(28G>A)。

3 討 論

ABO基因位于第9號染色體,由7個外顯子組成,共編碼354個氨基酸。ABO等位基因編碼區發生突變時可引起ABO基因編碼物質的改變,從而導致ABO亞型產生。目前研究ABO亞型主要有血清學水平(血液免疫學實驗)、基因水平(DNA、mRNA)、蛋白水平(氨基酸、糖基轉移酶、蛋白)3種模式[9-10]。因ABO基因77%的編碼系列位于第6和第7外顯子,本研究對38例血清學檢測ABO血型抗原表達異常標本第1～7外顯子編碼區進行測序分析,進一步闡述ABO血型亞型的分子生物學機制。

根據ISBT等位基因命名表,目前已確認300多種ABO等位基因。本研究結果表明,常州地區B亞型多于A亞型,與章旭等[11]的調查結果基本一致。本研究PCR-SSP法采用天津秀鵬生物試劑盒,該試劑盒根據中國人群常見ABO亞型設計,適用于我國采供血機構ABO血型基因分型的常規篩查。在38例標本中發現3例為突變型組合未收錄和2例新突變位點,這5例標本由西安浩瑞基因技術有限公司負責單倍體分型。結果表明,例1為突變型組合未收錄,其堿基突變有28G>A、261delG、297A>G、526C>G、657C>T、703G>A、796C>A、803G>C、903G>A,在單倍體2中出現了錯義突變28G>A,該突變位于第1號外顯子最后一個堿基處,它不僅改變了氨基酸種類,還有可能造成外顯子剪接錯誤。該突變雖未被ISBT收錄,但上海市血液中心蔡曉紅團隊已將序列提交到國際血型抗原基因突變數據庫,并在文章中首次報道28G>A錯義突變[12];但當時未對28G>A導致B3表型的機制展開研究。2017年蔡曉紅團隊繼續對該突變進行功能性研究,探討是剪接性能影響還是氨基酸改變,因此對含有該突變的單倍體cDNA采用實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應進行表達量評估,證實了28G>A突變會對剪接功能造成影響[13]。例8為突變型組合未收錄,其堿基突變有297A>G、467C>T、526C>G、657C>T、703G>A、796C>A、803G>C、838C>T、903G>A,在其中一條單倍體中發現了838C>T錯義突變引起p.Leu>Phe的改變;結合其他突變位點推測其為較罕見的Ax24,同時可上報ISBT申請新分型單倍體。例13為突變型組合未收錄,其堿基突變有297A>G、526C>G、657C>T、703G>A、761C>T、796C>A、803G>C、930G>A、261delG,在正常B1的格局中發生761C>T錯義突變;該突變型組合未被ISBT收錄,結合其他突變位點推測其為較罕見的BW30。

此外本研究還發現2例新突變位點,均并未被ISBT收錄(正提交NCBI命名中)。例12在A102/O01的基礎上第7外顯子發生了 1036A>C 的雜合突變。根據血清學結果推斷,該突變應位于A基因上的B單倍體發生了1036A>C錯義突變;血清學表型為Bw03。例17在A102純合的基礎上其第7外顯子第873號堿基發生了C>T的雜合突變并對其進行單倍體檢測,在單倍體2中發現了未被報道過的873C>T同義突變,該突變未造成氨基酸改變;從密碼子使用頻率來看,天門冬氨酸Asp的GAT使用頻率相對較低,因此推測該突變可能會對蛋白合成速度的造成影響;預測表型為A102,該突變點并未被NCBI數據庫收錄,可上報ISBT申請新基因。

綜上所述,本研究通過本地區獻血人群38例血清學檢測ABO血型抗原表達異常標本的基因多態性,初步了解其分布特征。當出現ABO抗原弱表達或ABO正反定型不符現象時,建議將血型基因分型技術與血型血清學技術結合運用,以防止血型分型判斷錯誤。我國為多民族國家,不同地域、不同民族人群的血型基因多態性存在差異,有條件的地區應建立本區域血型基因多態性數據庫,為精準輸血治療及輸血醫學發展提供樣本來源及理論基礎。