利用數據庫解析高原紅細胞增多癥與肺動脈高壓基因表達差異的關聯性*

申楊磊,方龍偉,央 拉,多吉卓瑪,巴桑卓瑪

西藏大學高原健康科學研究中心,西藏拉薩 850000

高原紅細胞增多癥(HAPC)是高原地區常見的慢性高原病之一,其主要特征為紅細胞過度增生,表現為血紅蛋白濃度顯著增加,其病變多呈慢性過程,后期常伴有全身多系統、器官、組織不同程度損害[1]。

根據世界衛生組織的分類,肺動脈高壓(PH)可分為動脈型PH、左心疾病所致PH、肺臟疾病和(或)低氧所致PH、慢性血栓和(或)栓塞性PH、多種未明機制所致PH 5類[2]。其中高原肺動脈高壓(HAPH)屬于第3類,是由于高原低氧環境,肺換氣代償性增加、血細胞比容升高、血管收縮引起的一種慢性高原病[3],與HAPC一樣,也是非常典型的危害高原人群健康的疾病,而且現有研究表明,HAPC與PH間存在共同的病理特征:(1)紅細胞與血紅蛋白增加;(2)肺泡壁明顯增厚,纖維增粗,彌散功能下降;(3)肺動脈壓力變化與紅細胞過度增生有關。HAPC的主要表現為紅細胞與血紅蛋白異常增加,對PH的文獻查閱結果同樣發現紅細胞與血紅蛋白增加,而紅細胞與血紅蛋白異常增加可對機體心、肺、腎等臟器功能造成損傷。此外,還有學者通過研究過度表達人類促紅細胞生成素(EPO)的轉基因小鼠,分析小鼠血液中紅細胞增生情況與肺動脈壓力的變化,發現PH的發生與紅細胞過度增生有直接關系[4-5]。有學者研究發現,HAPC患者肺泡壁明顯增厚和纖維增粗,使肺泡間質彌散功能下降,紅細胞的過度增加使肺動脈壓力明顯升高[6-8]。以上相關研究均表明HAPC與PH間具有相同的發病特征。但目前檢索到的HAPC與PH兩種疾病間的相關性研究較少,因此利用生物信息學工具對兩種疾病的相關數據進行檢索,篩選出共同的差異基因和信號通路,但因目前數據庫中關于HAPH相關基因的數據太少,本文就HAPC與PH的基因差異進行比較和分析,旨在為進一步探討HAPC與PH之間發病機制的異同及關聯提供理論依據。

1 材料與方法

1.1數據來源 使用GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)對以人類為研究樣本的HAPC與PH基因數據進行檢索,獲取GSE29977[9]、GSE53408[10]、GSE703[11]、GSE113439[12]4個數據集,對其研究選擇的樣本與研究方法進行篩選、排除后保留GSE29977與GSE53408數據集。GSE29977芯片屬于GPL570平臺[(HG-U133_Plus_2)Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array]基因芯片,共包括10個樣本,其中5例HAPC患者、5例健康對照者;GSE53408芯片屬于GPL6244平臺[(HuGene-1_0-st)Affymetrix Human Gene 1.0ST Array transcript(gene)version]基因芯片,共包括23例樣本,其中12例PH患者與11例健康對照者。

1.2差異基因篩選 通過R語言對數據集進行均一化處理后,使用Limma包[13]對數據中的差異基因進行篩選,然后在篩選結果基礎上使用Bonferroni法對P值進行校正,GSE29977數據集校正后P值應<0.01;GSE53408數據集校正后P值應<0.004 54;差異基因的篩選標準應滿足校正后P值且滿足log2|FC|>1。得到兩個數據集中符合標準的差異基因,再繪制韋恩圖進行重疊篩選,得到兩個數據集中共同的差異基因。

1.3基因本體(GO)分析、京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析、基因富集(GSEA)分析 DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)是具有多種生物數據和分析工具的軟件,可對目的數據進行富集分析,并提供注釋信息。本研究通過DAVID數據庫對篩選得到的共同差異基因進行GO分析、KEGG富集分析和功能注釋,篩選條件為P<0.05。GO分析結果由3個部分構成:生物學過程(BP)、分子功能(MF)及細胞成分(CC)。GSEA分析是將所有基因納入研究再篩選出差異顯著的富集通路,篩選條件為P<0.05。

1.4GeneCards分析 GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)包括了多種生物的基因數據和大量疾病相關基因,該數據庫對相關基因進行細致的分類,可以查閱到基因分布的組織、作用途徑和與疾病相關度的得分。故利用GeneCards數據庫對篩選到的差異基因進行檢索,觀察差異基因是否與相關疾病的致病基因相符、在人體組織中的分布是否與疾病相關。

2 結 果

2.1HAPC與PH基因篩選 GSE29977數據集標準化后進行富集分析,對富集出的差異基因進行篩選,得到1 627個差異基因(815個上調基因,812個下調基因),校正后符合篩選閾值(P<0.01;log2|FC|>1)的基因有396個,其中188個上調基因和208個下調基因。GSE53408數據集標準化后進行富集分析,篩選得到3 455個基因(695個上調基因,2 760個下調基因),校正后符合篩選閾值(P<0.004 54;log2|FC|>1)的基因有791個,其中695個上調基因和96個下調基因。將兩個數據集轉換為一致的基因ID并排除其中無名稱基因,對剩余基因使用維恩圖進行重疊篩選,共得到138個共同差異基因,校正后共同的差異基因有11個,分別為內皮細胞黏附分子(ESAM)、成纖維細胞生長因子18(FGF18)、主要組織相容性復合體(MHC)Ⅱ類人類白細胞抗原DQB1(HLA-DQB1)、同源異構體A7(HOXA7)、POZ/BTB和AT結合基序鋅指蛋白1(PATZ1)、整合素亞基B4(ITGB4)、甲基硫核糖-1-磷酸異構酶(MRI1)、基質金屬肽酶8(MMP8)、Caspase12、10號染色體開放閱讀框25(C10orf25)、H因子(CFH)。

2.2GO分析及KEGG分析 對138個差異基因進行功能注釋,然后進行GO分析以及KEGG分析。校正前,BP差異基因主要富集在:中胚層形態生成、初級胚層形成、原腸胚形成;CC差異基因主要富集在:黏附連接、細胞與細胞連接、蛋白酶體調控顆粒堿基亞復合物、間質矩陣、宿主細胞內部分等;MF差異基因主要富集在:激活轉錄因子、MHCⅡ類受體活性、UDP葡萄糖基轉移酶活性、腺苷脫氨酶活性、磷酸酪氨酸殘基結合等。KEGG分析提示差異基因主要富集在:內質網蛋白質加工、細胞外基質(ECM)受體相互作用、金黃色葡萄球菌感染、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等。

先對校正后的11個差異基因進行功能注釋,然后進行GO分析及KEGG分析。BP差異基因主要富集在初級胚層形成、原腸胚層形成,CC差異基因主要富集在MHCⅡ類蛋白復合物、復雜炎性體、核膜,MF差異基因主要富集在MHCⅡ類受體活性、半胱氨酸型內肽酶活性參與凋亡信號通路、胰島素樣生長因子Ⅰ結合等。KEGG分析提示差異基因主要富集在金黃色葡萄球菌感染、細胞黏附分子、肌動蛋白細胞骨架的調節。見圖1～4。

圖1 校正前差異基因GO分析結果

圖2 校正后差異基因GO分析結果

圖3 校正前差異基因 KEGG分析結果

圖4 校正后差異基因KEGG分析結果

2.3GSEA分析 由于得到的數據集差異基因較少,進一步使用GSEA分析對差異基因附近的通路進行分析,探索HAPC與PH的共同性。GSE53408數據集的GSEA分析結果顯示只有兩個通路具有顯著差異。細胞周期信號通路具有最高標準化富集得分[NES,NES=2.236 2,P<0.000 1,錯誤發現的比率(FDR)<0.014],其次為卵母細胞減數分裂通路(NES=2.014 0,P<0.001 2,FDR<0.027)。GSE29977數據集的GSEA分析結果并未發現兩種疾病間共同的信號通路,需要在未來進行進一步研究分析。見表1。

表1 GSEA分析篩選GSE29977數據集差異富集的信號通路

2.4GeneCards分析 通過GeneCards網站對篩選出的138個共同差異基因和校正后得到的11個差異基因數據進行分析。對未校正前篩選到的131個(有7個基因數據庫未能識別)共同差異基因檢索結果顯示,差異基因在人體多個組織均有表達,由于PH屬于心血管系統疾病(或循環系統疾病),故對心血管系統疾病的分類進行檢索分析,結果顯示與這131個共同差異基因相關的疾病中包含PH。對篩選到的138個差異基因與人類PH所有相關基因進行比對,結果顯示相同的基因有60個,與PH高度相關的基因有血管緊張素轉換酶(ACE)、微小RNA、SMAD通路蛋白(SMAD)、纖維母細胞生長因子(FGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)。

對校正后的11個差異基因進行對比,顯示有5個相同基因:FGF18、HLA-DQB1、PATZ1、MMP8、CFH。結果在疾病分類中未查閱到PH。對校正后11個差異基因進行檢索,結果顯示其中4個基因在肺部高表達,包括ESAM、FGF18、HLA-DQB1、PATZ1。PATZ1主要表達于肺莖支氣管中;ESAM表達于肺血管內皮細胞表面;HLA-DQB1表達在肺、血液、呼吸道上皮細胞表面、支氣管中部。對相關疾病的分析結果顯示,高血壓分類與PH相關性評分較高(相關性得分為34.1),故推測HAPC與PH間可能存在相關性。

3 討 論

通過知網和Pubmed兩個數據庫對本次篩選出的相關基因進行檢索,發現與本次篩選結果相同的基因有ACE、PDGF、HLA-DQB1。研究表明,ACE是腎素-血管緊張素系統產生,具有強烈的血管收縮作用。機體在低氧環境下促使ACE產生且受低氧誘導因子(HIF)調控,傅薇[14]研究表明HAPC患者骨髓單個核細胞、骨髓液、血液及骨髓的ACE水平均增高,證明ACE是HAPC的發生機制之一,同時ACE的同素體ACE2廣泛分布在心、腎、肺等器官,在肺中分布于Ⅰ型肺泡上皮細胞、Ⅱ型肺泡上皮細胞、支氣管上皮細胞、巨噬細胞、肺血管內皮細胞、平滑肌細胞。相關研究表明ACE可以促進血管緊張素2(AngⅡ)產生,AngⅡ可以誘發肺血管內平滑肌細胞遷移,刺激炎癥因子、轉化生長因子-β(TGF-β)產生,誘導肺實質細胞凋亡,AngⅡ還可進一步促進血管收縮及平滑肌細胞生長遷移,加重PH發生[15]。查閱現有PDGF相關研究結果顯示,PDGF家族包括PDGFA、PDGFB、PDGFC、PDGFD等。PDGF具有趨化、收縮血管、促進分裂作用,參與磷酸酯酶激活與前列腺素代謝。殷玉娟等[16]研究顯示,HAPC患者血小板活化,PDGF表達升高,血栓形成使得血液成分和血流狀態改變[17],可以使HAPC患者血氧飽和度下降10%[18],加重血管細胞損傷,促使血栓形成增加,故PDGF是HAPC的發病原因之一。彭虹艷[19]研究發現,PDGF可以在有氧環境下促進主動脈血管平滑肌細胞糖酵解增強,PDGF通過PI3K/AKT/mTOR信號通路上調HIF-1α,使得丙酮酸脫氫酶(PDH)磷酸化活性下降,產生肺動脈平滑肌Warburg效應,使得肺動脈平滑肌異常增殖、肺動脈重構,證明PDGF在PH的發生過程中發揮重要作用。檢索現有與人類白細胞抗原系統(HLA)相關文獻,結果顯示其具有高度基因多態性,其中DQA1和DQB1具有多種免疫學功能,且已有研究表明HLA除與免疫系統疾病相關外,還與呼吸系統、消化系統、心血管系統疾病存在相關性[20]。青格樂圖等[21]對青海地區HAPC患者人類白細胞抗原DQA1(HLA-DQA1)和HLA-DQB1的6個等位基因與健康對照者進行對比,結果發現HLA-DQB1與肺動脈高壓的發生密切相關[22]。通過對已有文獻進行查閱,與本次分析篩選到的差異基因進行對比,結果顯示有多個已驗證的疾病相關基因,其余未驗證的差異基因需在未來進行實驗驗證。

本研究還存在以下不足:(1)在GEO數據庫中檢索到的研究樣本較少;(2)GeneCards在線數據庫分析結果與目前已有的基因研究結果相符的數據較少;(3)GSEA分析結果未發現共同的信號通路,需進一步進行分析研究;(4)本研究僅是對GEO數據庫中已有的相關研究數據進行分析研究,需要進行實驗驗證。

綜上所述,本研究為HAPC與PH的相關研究提供了思路和研究方向,下一步可對篩選的差異基因進一步分析,并進行功能驗證進而探索不同的PH類型與HAPC的相關性。