慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平與牙周臨床指標和炎性因子的相關性研究*

張 婧,汪 靜

陜西省寶雞市中心醫院口腔科,陜西寶雞 721000

慢性牙周炎是指微生物在牙周長期定植、繁殖,并向牙周深部組織擴散引起的牙齒支持組織慢性炎癥,該病是臨床常見的慢性口腔炎癥性疾病[1]。研究表明,慢性牙周炎可以引起口腔異味、牙齦腫痛、牙齦出血等癥狀,如未給予及時有效的治療,炎癥往牙周深部組織進展,引起牙齦退縮、牙周膿腫,甚至牙齒脫落[2]。目前臨床上對于慢性牙周炎主張早期診斷并給予及時治療,尋找慢性牙周炎病情評估的指標對于指導臨床治療具有重要的價值。齦溝液是由牙齦結締組織分泌的一種液體,其成分可以反映牙周炎癥反應情況[3]。乳鐵蛋白(LF)是由中性粒細胞脫顆粒過程中產生的蛋白,具有抗菌、抗氧化、調節免疫功能等作用,其水平還可以反映炎癥反應情況[4]。音猬因子(Shh)蛋白是Hedgehog信號通路的重要因子,也是Hedgehog蛋白家族的重要成員,在組織修復、細胞再生和炎癥損傷中發揮重要作用[5]。髓樣細胞觸發受體-1(TREM-1)是BOUCHON等[6]于2001年報道的炎性因子,與炎癥反應有密切關系。慢性牙周炎患者齦溝液中LF、Shh蛋白、TREM-1水平與牙周臨床指標及炎性因子的關系尚不清楚。鑒于此,本研究進行了相關分析,以期為慢性牙周炎的臨床診治提供一定參考,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2021年1-12月收治的慢性牙周炎患者104例作為研究組,其中男66例、女38例,年齡32～65歲、平均(43.55±6.12)歲,病程6～9年、平均(3.04±1.57)年。納入標準:(1)入組患者符合《牙周病學(第4版)》關于慢性牙周炎的診斷標準[7];(2)患者口腔X線片檢查顯示存在牙槽骨部分吸收,牙頸部無牙體病變;(3)全口余留牙≥18顆;(4)患者入組前2個月內未服用抗菌藥物及使用含漱液,未接受過其他牙周治療。排除標準:(1)合并糖尿病、心腦血管疾病、慢性肝腎疾病患者;(2)合并牙髓炎及侵襲性牙周炎患者;(3)合并免疫系統疾病患者;(4)近半年內有創傷、感染及手術史患者;(5)妊娠、哺乳期女性。另選取同期在本院進行口腔檢查的健康志愿者30例作為對照組,其中男18例、女12例,年齡33～62歲、平均(43.06±4.68)歲。研究組與對照組性別、年齡比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經本院醫學倫理委員批準,患者及家屬對本研究知情同意。

1.2方法

1.2.1牙周臨床指標檢測 所有患者進行除第3磨牙外的全口牙周臨床檢查,每顆牙分別選取舌側、頰側的遠中、正中和近中共計6個位點檢測探診深度(PD)、附著喪失(AL)和出血指數(BI),最后取平均值作為檢測結果。PD為齦緣至牙周袋底部或齦溝底部的距離。牙齦無萎縮時,AL為PD減去釉牙骨質界到齦緣距離;當發生牙齦萎縮時,AL為PD與釉牙骨質界到齦緣距離之和。使用牙周探針對牙周袋或齦溝進行探診,取出探針30 s后觀察牙齦出血情況,記錄BI。0分:牙齦健康、無出血;1分:牙齦有炎性改變,但探診時無出血;2分:牙齦探診后出現點狀出血;3分:牙齦探診后有明顯出血,牙齦裂開;4分:牙齦探診后劇烈出血;5分:牙齦自動出血[7]。選取舌側邊緣齦、頰側近中齦乳頭、頰側遠中齦乳頭、頰側邊緣齦4個位點記錄炎癥反應情況。0分:牙齦健康;1分:牙齦輕度炎癥;2分:牙齦中度炎癥;3分:牙齦重度炎癥,將4個位點得分求平均值作為牙齦指數(GI)[8]。

1.2.2齦溝液采集 探診兩組研究對象后去除牙齦軟垢和菌斑,吹干牙面,用2 mm×10 mm的Whatman濾紙深插入齦溝底部,停留30 s,取出濾紙并放入EP管中。EP管中預先放入0.2 mL的磷酸鹽緩沖液(PBS),震蕩1 h,3 000 r/min離心10 min,離心半徑12 cm,取上清液。

1.2.3齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1及炎性因子的檢測 應用酶聯免疫吸附試驗測定齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6、IL-7水平。將上清液分裝,取原倍的標準品150 μL進行稀釋,取96孔板,分別設置標準孔、空白孔、待測樣品孔。首先進行酶標包被,加入標準品50 μL,然后加入40 μL樣品稀釋液和10 μL待測樣品,輕輕搖晃混勻樣品,封板后置于37 ℃恒溫條件下孵育30 min。拆掉封膜后將液體棄用,拍干,除空白孔外每個孔加入酶標液50 μL,顯色劑A、B各50 μL,震蕩混勻,在37 ℃恒溫條件下避光顯色15 min。加入終止液50 μL,15 min后在450 nm波長下觀察吸光度值,并計算待測樣品中相關指標的水平。LF、Shh蛋白檢測試劑盒購自上海百蕊生物科技有限公司,TREM-1檢測試劑盒購自上海初態生物科技有限公司,TNF-α、IL-6、IL-7檢測試劑盒購自北京伊諾凱科技有限公司。所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3慢性牙周炎病情嚴重程度的評估[7]輕度:GI<1,PD<4 mm,AL為1～2 mm,牙齒松動不明顯;中度:GI為1～2,PD為4～6 mm,AL為>2～4 mm,牙齒輕度松動,多根牙出現輕度分叉病變;重度:GI>2,PD>6 mm,AL>4 mm,牙齒多處松動,牙根分叉明顯。

2 結 果

2.1兩組齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平比較 研究組齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平比較

2.2不同病情嚴重程度慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平比較 根據病情嚴重程度將患者分為輕度組38例、中度組44例、重度組22例。重度組患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平顯著高于中度組、輕度組(P<0.05);中度組患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平顯著高于輕度組(P<0.05)。見表2。

表2 不同病情嚴重程度慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平比較

2.3不同病情嚴重程度慢性牙周炎患者牙周臨床指標比較 重度組患者PD、AL、BI、GI顯著高于中度組、輕度組(P<0.05);中度組患者PD、AL、BI、GI顯著高于輕度組(P<0.05)。見表3。

表3 不同病情嚴重程度慢性牙周炎患者牙周臨床指標比較

2.4不同病情嚴重程度慢性牙周炎患者齦溝液炎性因子水平比較 重度組患者齦溝液TNF-α、IL-6、IL-17水平顯著高于中度組、輕度組(P<0.05);中度組患者齦溝液TNF-α、IL-6、IL-17水平顯著高于輕度組(P<0.05)。見表4。

表4 不同病情嚴重程度慢性牙周炎患者齦溝液炎性因子水平比較

2.5慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1與牙周臨床指標和炎性因子的相關性 Pearson相關分析顯示,慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平與PD、AL、BI、GI及齦溝液TNF-α、IL-6、IL-17水平均呈正相關(P<0.05)。見表5。

表5 慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1與牙周臨床指標和炎性因子的相關性

3 討 論

慢性牙周炎的主要病因是牙齒和牙齦交界處的齦溝內、牙面內的病原微生物大量繁殖,引起牙周慢性炎癥,并形成牙周袋和牙菌斑,炎癥反復遷延不愈,最終造成牙槽骨吸收、牙齒松動[9]。慢性牙周炎造成的牙周支持組織損傷是不可逆的,因此,臨床上對于慢性牙周炎應早期診斷,及時治療。齦溝液是由牙齦結締組織分泌的一種液體,當牙周發生炎癥時,組織細胞可以分泌和表達大量的炎性因子,通過檢測齦溝液中炎性因子水平可以反映炎癥反應情況[10]。因此,尋找慢性牙周炎齦溝液特異性分子對于疾病診治具有重要的意義。

本研究對慢性牙周炎患者及健康志愿者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平進行了比較。LF是一種鐵離子結合糖蛋白,最初在牛乳汁中分離獲得[11]。研究表明,LF廣泛存在于哺乳動物體內,其中人初乳中LF含量為20%以上,在唾液、胃液等分泌物中LF含量也較高[12]。研究表明,在中性粒細胞脫顆粒過程中可以產生LF,LF具有抗炎癥反應的作用[13]。Shh蛋白是一種分泌型蛋白,是Hedgehog蛋白家族的重要成員[14]。研究表明,Shh蛋白在細胞內通過一系列的催化修飾和裂解與膽固醇共價結合,并與軟脂酰輔酶A發生反應,完成蛋白修飾,分泌到細胞外發揮作用[15]。研究表明,Shh蛋白可以通過啟動Hedgehog信號通路發揮促炎作用[16]。TREM-1主要表達于單核巨噬細胞表面和中性粒細胞表面,它可以與Toll樣受體(TLR)2和TLR4結合并被激活,從而啟動炎癥反應[17]。BOSTANCI等[18]報道指出,牙周組織中存在TREM-1異常表達,其水平與慢性牙周炎的發生有關。本研究結果顯示,慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平異常升高,且隨病情嚴重程度的增加慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平逐漸升高,表明LF、Shh蛋白、TREM-1可能與慢性牙周炎的發生、發展有關。分析原因可能與以下幾方面有關:(1)慢性牙周炎是牙齒支持組織的慢性炎癥,炎癥細胞的浸潤在疾病發生、發展中起重要作用,而在中性粒細胞浸潤過程中會啟動中性粒細胞脫顆粒,并分泌大量的LF,導致齦溝液中LF水平升高[19];(2)在慢性牙周炎發病過程中Shh蛋白水平升高,并啟動Hedgehog信號通路,發揮促炎作用[20];(3)在慢性牙周炎發病過程中也會導致單核巨噬細胞和中性粒細胞激活,而TREM-1主要表達于單核巨噬細胞表面和中性粒細胞表面,其水平升高可能與牙周組織單核巨噬細胞、中性粒細胞聚集,啟動炎癥反應有關[21]。另外隨著病情的加重,牙周的炎癥反應更加劇烈,炎癥細胞浸潤程度增加,因此,齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平越高。

本研究結果顯示,隨著疾病嚴重程度的增加,慢性牙周炎患者PD、AL、BI、GI逐漸升高。PD、AL、BI、GI是反映慢性牙周炎嚴重程度的重要臨床指標。隨著慢性牙周炎的病情加重,炎癥可以向牙周深部組織逐漸進展,引起牙齦萎縮、牙周膿腫、牙周袋形成,導致PD、AL、BI、GI升高。本研究結果表明,隨著疾病嚴重程度的增加,慢性牙周炎患者齦溝液TNF-α、IL-6、IL-17水平逐漸升高。TNF-α可以作用于機體血管內皮細胞,導致血管內皮損傷,引起組織缺血和炎癥反應[22]。TNF-α還可以直接參與炎癥反應,促進機體產生膠原酶,導致組織壞死和吸收[22]。IL-6是主要由T淋巴細胞、單核巨噬細胞、血管內皮細胞產生的炎性因子,具有促進中性粒細胞聚集和活化的作用[23]。IL-17是輔助性T細胞17(Th17)分泌的特異性因子,它能夠激活T淋巴細胞,發揮促炎作用[24]。在慢性牙周炎的發生和發展中,TNF-α可能引起牙周組織缺血和損傷,并促進牙周炎癥反應[25],而IL-6、IL-17可能與機體免疫細胞激活,炎癥反應激活有關[26]。

本研究結果還顯示,慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平與PD、AL、BI、GI及齦溝液TNF-α、IL-6、IL-17水平呈正相關,表明齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平可以反映慢性牙周炎病情及炎癥反應情況。臨床上由于慢性牙周炎的早期診斷對于治療非常重要,而目前臨床上對于慢性牙周炎的診斷仍主要依據PD、AL、BI、GI等臨床指標,但檢測可能帶來一定的創傷。相對于全口牙周臨床檢查,齦溝液采集則更為方便,也方便動態觀察。本研究結果也提示檢測齦溝液中LF、Shh蛋白、TREM-1對慢性牙周炎的診斷有一定的指導價值。

綜上所述,慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平異常升高,其水平與牙周臨床指標和炎性因子呈正相關,LF、Shh蛋白、TREM-1水平可以反映疾病嚴重程度,檢測齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1可以輔助評估慢性牙周炎的病情。