基于高通量測序技術的105例AML和MDS患者驅動基因突變譜差異性分析

王曉鳳,沈依帆,詹 茜,廖 鑫,吳 江,趙 潔,楊梓涵,江 珊,程 偉,張玉洪,陳雪萍

重慶醫科大學附屬第一醫院臨床分子醫學檢測中心,重慶 400016

急性髓系白血病(AML)和骨髓增生異常綜合征(MDS)均是造血系統的髓系原始細胞克隆性惡性增殖性疾病,是一類具有高度異質性的疾病群。目前,隨著靶向治療藥物的誕生,靶向治療成為熱點。研究發現,AML和MDS存在多種驅動基因突變[1]。較常見的突變基因包括FLT3、NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、NRAS、KRAS、RUNX1、TET2、TP53、CEBPA等?；隍寗踊蛲蛔儗ML及MDS患者的靶向治療和預后分層已經寫入相關指南/共識[2]并在臨床診療中實踐。AML和MDS的基因突變譜特征有差異,與臨床鑒別診斷、治療監測有關,但關于西南地區乃至全國人群的報道較少。高通量測序技術(NGS)作為新型的分子生物技術,具有高通量、高靈敏度、高重復性等特點,幾乎所有患者均可篩查出相關基因突變,對于AML和MDS在分子水平鑒別有一定的優勢[3]。

因此,本研究采用NGS對初診為髓系白血病的患者進行髓系血液腫瘤相關的基因檢測,并結合流式細胞術檢測細胞表面分化抗原,對與AML和MDS診斷相關的高表達抗原分子進行統計與分析,篩選陽性率較高的DNMT3A、FLT3、NPM1、SRSF2、RUNX1、IDH1、TET2、GATA2等基因[2]作為候選研究基因,總結基因突變頻譜,分析基因突變與患者基線資料和臨床診斷的相關性,探討AML和MDS的差異性基因指標。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2019年9月至2022年12月收治的髓系白血病患者作為研究對象,其中71例AML患者和34例MDS患者。將AML和MDS患者分別按年齡進行分組,年齡≥60歲納入老年組,年齡<60歲納入中青年組。所有研究對象均經骨髓形態學、流式免疫分型、細胞遺傳學及分子生物學(MICM)檢測,并結合臨床表現,符合現行的AML和MDS診斷及分型標準[2-4],且均進行了相關基因的NGS突變譜檢測。將NGS檢測結果中在本次研究范圍內的高頻次基因突變的患者納入病例組。排除既往或復發患者;合并其他相關疾病患者;多種腫瘤患者;合并心、肺、肝、腎功能障礙者;合并全身感染性疾病患者;門診患者或沒有詳細基礎資料和治療史的患者;本次研究范圍外的基因突變患者。

1.2儀器與試劑 儀器:移液器(Eppendorf)、熒光定量儀QubitR 3.0 Fluorometer、渦旋混勻器(其林貝爾QB-328)、恒溫金屬浴(奧盛MiniT-H2C)、微型高速離心機(Mini-15K)、梯度PCR儀(Tadvanced 96G)、二代測序儀(Illumina miniseq,NextSeq CN500)、流式細胞儀(Navios)。試劑:源奇AML/MDS/MPN相關38基因突變檢測試劑盒、血液腫瘤相關基因突變檢測試劑盒(100+)、天根血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、新百基核酸提取或純化試劑(M2002-A32)、貝克曼庫爾特抗體、BD抗體、北京化工無水乙醇(分析純)、無核酸酶水。

1.3方法 常規抽取患者骨髓2～4 mL,保存于普通乙二胺四乙酸抗凝采血管中,取樣后常溫(15～35 ℃)或2～8 ℃運輸,24 h內送至實驗室進行骨髓DNA的抽提。再通過構建原始DNA文庫,擴增目的片段,純化PCR,連接接頭及制備富集文庫,采用二代測序儀進行基因測序,測序后的原始數據利用千人基因組、Cosmic、ClinVar、dbSNP等數據庫進行生物信息學分析,確定致病性突變基因位點。白細胞計數采用患者初診時的血細胞分類計數結果,細胞表面分化抗原分型結果基于本中心流式細胞儀對患者初診時的免疫細胞分型進行檢測。

1.4統計學處理 采用SPSS26.0軟件進行統計分析。經Shapiro-Wilk檢驗,本研究中計量資料均不符合正態分布,以M(P25,P75)表示,組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗;計數資料以例數或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1AML及MDS患者不同年齡組的基線資料比較 AML患者中老年組21例,中位年齡68歲,中青年組50例,中位年齡45歲,兩組年齡比較,差異有統計學意義(P<0.05);AML患者中老年組男性占比為76.2%,中青年組男性占比為38.0%,差異有統計學意義(P<0.05)。MDS患者中老年組11例,中位年齡72歲,中青年組23例,中位年齡55歲,兩組年齡比較,差異有統計學意義(P<0.05);MDS患者中老年組男性占比為54.5%,中青年組男性占比為65.2%,差異無統計學意義(P>0.05)。兩類患者不同年齡組的白細胞計數及流式細胞分化抗原CD7、CD11b、CD56比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1～2。

表1 AML患者不同年齡組基線資料比較[M(P25,P75)或n(%)]

表2 MDS患者不同年齡組基線資料比較[M(P25,P75)或n(%)]

2.2AML和MDS基因突變譜 本研究采用NGS對診斷AML和MDS有意義的常見基因進行測序。通過統計學方法遴選出其中突變比例較高的基因主要為ASXL1、CEBPA、TP53、DNMT3A、FLT3、NPM1、SRSF2、RUNX1、IDH1、TET2、FLT3-ITD、FLT3-TKD、GATA2等基因,涵蓋了髓系白血病常見的突變基因。分析發現,在AML中DNMT3A基因突變與年齡有一定關系,DNMT3A基因在老年組AML患者中的突變頻率為38.1%,而該指標在中青年組AML患者中的突變頻率為12.0%,差異有統計學意義(P<0.05)。但其他高頻突變基因在AML和MDS患者不同年齡分組中比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3～4。

表3 AML患者不同年齡組基因突變頻率比較[n(%)]

表4 MDS患者不同年齡組基因突變頻率比較[n(%)]

2.3AML和MDS基因突變差異性特點 CEBPA基因在AML和MDS中的突變頻率分別為23.9%和2.9%;FLT3基因在AML和MDS中的突變頻率分別為32.4%和11.8%;RUNX1基因在AML和MDS中的突變頻率分別為9.9%和26.5%。AML和MDS患者CEBPA、FLT3、RUNX1、FLT3-TKD基因突變頻率比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。AML和MDS患者NPM1和ASXL1等基因突變頻率比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 AML與MDS患者中各基因突變頻率比較[n(%)]

3 討 論

本回顧性研究結果顯示,在初診為髓系白血病患者中,老年組(年齡≥60歲)發生相應基因突變頻率高于中青年組:老年組AML患者中ASXL1、TP53、DNMT3A、NPM1、SRSF2等基因突變頻率高于中青年組;而在老年組MDS患者中CEBPA、DNMT3A、FLT3、SRSF2、RUNX1、IDH2等基因變頻率高于中青年組。有研究顯示,AML的中位發病年齡為67歲[5]。老年AML患者占AML患者的一半以上[6-7];老年患者發生MDS可能與隨年齡增長的進行性造血功能衰退和突變積累有關[6-7],因此,上述基因是否可以作為西南地區AML和MDS鑒別診斷的依據,可以擴大樣本量再進行研究。同時,本研究發現,性別與疾病的發生也有一定的關系,AML患者中老年組男性占比高達76.2%,而在MDS患者中中青年組和老年組男性占比均過半,可能與男性的不良生活習慣有一定關系,但由于樣本量較少,未發現具有統計學意義的結果,還有待進一步擴大樣本量來驗證。

本研究西南地區髓系白血病患者NGS檢測結果聯合流式細胞分化抗原結果顯示:NGS檢測結果與報道過的中國人群髓系白血病基因突變譜一致,高頻突變基因主要是ASXL1、CEBPA、TP53、DNMT3A、FLT3、NPM1、SRSF2、RUNX1、IDH1、TET2等,符合我國人群基因突變譜[8-11]。這些高頻突變基因也是美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)指南中提及的與血液腫瘤的診斷密切相關的基因[2]。在本研究中,AML和MDS患者單個基因突變比較,AML患者CEBPA、FLT3、NPM1、IDH1等基因突變頻率高于MDS患者,MDS患者ASXL1、RUNX1等基因突變頻率高于AML患者。CEBPA[12-14]、RUNX1[15-16]、ASXL1基因[17]的突變檢測均可作為髓系白血病鑒別診斷的指標之一。而本研究發現,NPM1、SRSF2、DNMT3A、GATA2、TP53等基因突變頻率在兩種疾病之間比較,差異無統計學意義(P>0.05),與相關研究結果略有不符[3,18],可能與西南地區人群特殊的飲食習慣和生活作息有關,以上基因是否可以作為AML和MDS的鑒別診斷依據還需進一步擴大樣本量進行研究。由上述對比可見:AML和MDS患者的基因突變譜明顯不同,利用這些基因的差異性突變,結合NGS技術可在髓系血液腫瘤的前期診斷、發病機制研究、驅動基因的發現等方面發揮重要作用。

NGS具有靈敏度高、通量高的優點,可同時檢測多個基因、多個位點、多種突變形式,大大降低了對樣本量的要求,并且可以構成不同的基因組合,有利于醫生對基因和項目的選擇,臨床應用的空間大,而且幾乎所有的患者都能篩查出基因突變,這在早期診斷和治療中有較高的價值。目前,已經有大量研究報道NGS可用于髓系白血病的診斷、個性化治療和微小殘留灶(MRD)的監測[19-20]。盡管國外已經進行了大批量樣本的研究,但對我國尤其是西南地區人群的研究仍然可以發現新的、不同于國外人群的特征。尤其是在NGS測序完成后,生物信息分析人員在對臨床意義尚未明確的變異結果進行解讀時,是否可以結合我國人群基因數據庫來解讀可以作為后期的研究方向。因為我國人群的遺傳方式、生活飲食習慣及環境因素與西方人不同,而用現在的數據庫來解釋我國人群基因突變譜其可靠性會略低。因此,將基因檢測數據與臨床資料整合起來,建立符合西南地區乃至我國人群的基因數據庫具有非常重要的意義。但基于二代測序儀的NGS具有建庫流程煩瑣,測序時間長,每次只能添加1個dNTP的特點,雖然能夠很好地解決測量同聚物長度準確率低的問題,但它的主要測序錯誤來源是堿基的替換,錯誤率較高;而讀長短(200～500 bp)的特點也讓其應用存在局限性。

綜上所述,利用NGS綜合分析比較西南地區AML和MDS兩種疾病MICM的差異,并結合流式細胞技術及臨床基本資料,后續再結合臨床治療方案、轉歸及患者生存資料進行歸納分析,有益于建立西南地區AML和MDS患者的基因數據庫,致力于AML和MDS的精準診斷、預后分層及MRD的監測,有助于理解兩種疾病分子層發病機制的異同。