結直腸癌組織中CDK1、IL-33表達及與其腫瘤惡性生物學行為的關系研究

向 前 韓玉超 李 閃

結直腸癌(CRC)是高發于結直腸內的消化道常見惡性腫瘤[1]。其發病機制復雜,在個體遺傳易感性的基礎上,由行為因素、環境以及生活方式等多種因素共同導致的結果[2-4]。細胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)是真核細胞周期重要調控因子,可與細胞周期蛋白的結合驅動細胞周期進程[5]。白細胞介素-33(IL-33)屬于白細胞介素-1家族,與多種消化道惡性腫瘤的發病機制密切相關[6]。既往研究表明,基因表達差異、慢性炎癥狀態與CRC腫瘤的增殖、轉移以及侵襲密切相關[7-8]。但目前臨床上關于CRC患者癌組織中CDK1、IL-33表達是否于不同組織中存在差異,且差異是否會影響CRC腫瘤惡性生物學行為臨床研究較少。基于此,本文特探討CRC患者癌組織中CDK1、IL-33表達與腫瘤惡性生物學行為的關系,以其明確CDK1、IL-33表達與腫瘤惡性生物學行為關系,為CRC診斷及治療提供新思路,報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月至2019年6月于我院進行就診的CRC患者66例的病理組織標本。納入標準:①病理組織確診為CRC[9];②臨床資料完整;③接受手術治療前未進行CRC相關治療。排除標準:①合并內分泌疾病;②合并其他惡性腫瘤;③患者精神異常。另選取66例患者中癌旁組織(距離癌組織邊緣最短距離>5 cm)37例。

1.2 方法

研究標本經4%多聚甲醛固定液(北京康佳宏原生物科技有限公司)固定、石蠟包埋、4 μm厚度連續切片。應用免疫組織化學法進行染色,石蠟切片后依次放入二甲苯[國藥錦奇(上海)化學試劑有限公司生產]中進行脫蠟,梯度無水乙醇水化(福州邁新公司生產),加3%雙氧水(H2O2,福州邁新公司生產)溶液以滅活內源性過氧化物酶活性,再用磷酸緩沖鹽溶液(PBS,福州邁新公司生產)沖洗三遍,每次3 min,用濾紙吸干切片組織周圍PBS,加入一抗(CDK1抗體、IL-33抗體,紐普生物生產),讓抗體充分將組織進行無氣泡覆蓋,置于4 ℃冰箱孵育過夜,次日拿出放置于室溫下進行復溫1 h,甩去一抗,PBS流動沖洗三遍,每次3 min。甩干PBS后,擦干組織,加入二抗(快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物,紐普生物生產),讓抗體充分將組織進行無氣泡覆蓋,放于濕盒內20 min,PBS流動沖洗三遍,每次3 min。滴加DAB染色液(蒸餾水0.85 mL,依次加入A、B、C液各50 μl,充分進行混勻,福州邁新公司生產),使組織被充分覆蓋,放于顯微鏡下觀察顯色反應,顯色反應完成后用自來水沖洗組織1 min,將切片置入蘇木精染液(上海恒遠生物生產)2 min,自來水沖洗30 s;放入1%的鹽酸酒精分化數秒,再放入流水下沖洗30 s;氨水返藍30 s,再用流水沖洗30 s,再將切片依次放入95%酒精-無水乙醇-二苯甲各5 min,進行脫水封片。胞質和(或)胞核中發現棕黃色或者黃褐色顆粒則表示細胞染色陽性,再于光學顯微鏡下隨機選取高倍視野(400倍)觀察每張切片,并計數細胞500個,依據陽性細胞占比不同分為以下五類等級:0分,陽性細胞占比<5%;1分,陽性細胞占比5%～25%;2分,陽性細胞占比26%～50%;3分,陽性細胞占比51%～75%;4分,陽性細胞占比76%～100%。根據著色強度再進行半定量判定,評分標準:不著色為0分;著色弱(淡黃色)為1分;中等著色(黃色)為2分;強著色(棕褐色)為3分。免疫反應的得分=陽性細胞的占比得分×免疫染色強度得分:陰性表達兩者乘積為0分,免疫組織化學反應(-);弱陽性表達兩者乘積為1～4分(+),中度陽性表達兩者乘積為5～8分(++),強陽性表達兩者乘積為9～12分(+++)。IL-33抗原陽性反應為細胞胞質中觀察到有黃色顆粒,與背景顏色比較,無色計0分、淡黃色計1分、黃顏色計2分及棕褐色計3分;陽性細胞占比評分:顯微鏡下隨機選取10個代表性視野計算陽性表達率,陽性表達率<5%(-,0分)、5%～25%(+,1分)、26%～50% (++,2分)和>50%(+++,3分),本研究中將“-～+”視為低表達,“++～+++”視為高表達。陰性對照用PBS標本,陽性對照用實驗室已知陽性標本。

基于上述現狀，提出的改善思路為：在深南大道主輔路匯入點設置預信號，實現輔道進入交通主路節點聯動組織，改善城市干道節點通行能力. 當主線預信號紅燈亮起時，輔路的預信號綠燈亮起，輔路車輛可快速進入左轉、掉頭車道，避免沖突.

1.3 隨訪

指定一名護士通過患者門診復診、電話或微信隨訪方式對患者及其家屬進行為期3年隨訪,以掌握患者CRC復發、轉移及生存情況,隨訪的截止日期為2022年6月,并統計CRC患者無進展生存期(PFS),其中PFS為患者術后至第一次發生CRC疾病進展或死亡時間[10]。

1.4 統計學方法

CRC是一種消化道惡性腫瘤,可嚴重威脅人類生存健康,據近幾年流行病學調查資料顯示,其發病率正呈明顯上升趨勢,且趨于年輕化[11]。其中手術切除是CRC優選的治療方法,術后患者5年生存率可達90%以上,但如果合并遠處轉移,患者生存率則會顯著降低[12-13]。因此,CRC的早期篩查、早期診斷是治療CRC的關鍵。

2 結果

2.1 CDK1、IL-33在CRC組織與癌旁組織中表達差異對比

軍隊能執行，因為要求雖然簡潔，但抓住了根本，只要簡單的條款做到了，其他要求也就做到；企業員工難執行，是因為要求太多了，不一定抓到要害，規定太多，做到這條，違了那條，久而久之，難以堅持。

CDK1、IL-33在CRC組織中表達水平均高于癌旁組織(P<0.05),見表1。

表1 CDK1、IL-33在CRC組織與癌旁組織中表達差異對比(例,%)

2.2 CDK1、IL-33表達與CRC臨床病理特征的關系

截止2022年6月,CDK1高表達患者無進展生存期(PFS)為33.58個月,短于CDK1低表達患者35.12個月(logRankχ2=5.627,P<0.05),IL-33高表達患者PFS為33.95個月,短于IL-33低表達患者35.64個月(logRankχ2=4.696,P<0.05),見圖1、2。

冰醋酸(CH3COOH)、硝酸(HNO3)、鹽酸(HCl)、氫氧化鉀(KOH)、氫氧化鈉(NaOH)、碳酸鈉(NaCO3)、硝酸鐵(Fe(NO3)3)、鄰苯二甲酸氫鉀(C8H5KO4)、四氯化碳(CCl4)、無水乙酸銅(Cu2(CH3COO)4)、吡啶(C5H5N)、硫酸銅(CuSO4)、硫酸鉛(PbSO4)均為分析純。

表2 CDK1、IL-33表達與CRC臨床病理特征的關系(例,%)

2.3 不同CDK1、IL-33表達水平患者PFS對比

低分化、淋巴結轉移以及TNM分期高的CRC患者腫瘤組織中CDK1、IL-33表達水平越高(P<0.05),見表2。

圖1 不同CDK1表達水平PFS圖

圖2 不同IL-33表達水平PFS圖

2.4 多因素分析

在66例CRC組織中,CDK1高表達率為59.09%(39/66),IL-33高表達率為68.18%(45/66),其中IL-33高表達同時CDK1高表達36例,兩者表達情況呈正相關(P<0.05),見表4。

表3 多因素分析

2.5 CDK1與IL-33表達的相關性

CDK1高表達、IL-33高表達、腫瘤細胞低分化、淋巴結轉移以及TNM分期Ⅲ期均是患者病情進展的危險因素(P<0.05),見表3。

表4 CDK1表達與IL-33表達的相關性/例

3 討論

應用SPSS 22.0版軟件對數據進行統計學分析,計數資料(%),采用卡方檢驗;相關性分析應用Spearman秩相關性檢驗;P<0.05,數據間差異存在統計學意義。應用GraphPad Prism5.0軟件、Kaplan-Meier生存曲線分析CDK1、IL-33與CRC患者3年PFS的相關性,選用Log-rank法,檢驗標準P<0.05。

本研究顯示,CRC腫瘤細胞分化程度、淋巴結轉移以及TNM分期中CDK1、IL-33表達水平存在差異,且腫瘤細胞低分化、伴淋巴結轉移以及TNM分期越高,腫瘤組織中CDK1、IL-33表達水平越高,其PFS則相對較短,說明CDK1、IL-33表達與腫瘤惡性生物學行為可能存在關聯。分析原因可能為:CDK1可調控真核細胞有絲分裂細胞周期G1/S和G2/M期,與CRC的發生、進展以及預后情況息息相關,在多種腫瘤細胞中CDK1表達失調呈現出過度表達狀態,能直接導致人體細胞周期生理過程出現紊亂,細胞分化過程發生障礙,促進CRC細胞的惡性增殖與轉化[14-15]。而細胞白介素在機體免疫反應調節與細胞活化增殖環節中發揮著重要作用,其中IL-33為白介素家族中主要的促進癌變因子,可與其受體蛋白ST2結合活化核轉錄因子κB與促分裂原活化蛋白激酶,以及信號通路上調環氧化酶2分泌和通過前列腺素E2途徑改變巨噬細胞浸潤與極化,從而調節基因轉錄,重塑腫瘤微環境,繼而促進CRC侵襲與遠處轉移[16-17];這均進一步提示CDK1、IL-33表達情況與CRC疾病進展密切相關,當二者在患者CRC組織中表達水平上調時,預示患者腫瘤組織惡性程度越高,更易轉移且易發生預后不良,PFS進一步縮短[18-19]。

本研究還發現,CDK1與IL-33表達呈正相關,說明CDK1與IL-33表達相互影響。分析原因可能為,IL-33參與機體炎癥、感染以及免疫反應等多種生物學活動,其可通過激活過磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路,有效抑制細胞線粒體凋亡通路,維持腫瘤細胞存活機制,減弱腫瘤細胞自我凋亡能力,從而促進CDK1顯著表達,進而影響細胞周期進程,使細胞周期由G2/M檢驗點向異常M期方向推進,促進CRC腫瘤細胞異常增殖與轉化[20]。

鋁土礦中w(SiO2)≥10%，換算得到w(Si)≥4.67%，試液中的硅主要以石英態和可溶性硅酸鹽形式存在，石英態形式存在的二氧化硅在鹽酸溶解過程中不參與反應，而以可溶性硅酸鹽形式存在的硅會與鈣結合生成不溶性的硅酸鈣，在溶解過濾過程中可被有效地去除，因此硅不會干擾硫酸根的測定。

綜上,CRC患者癌組織中CDK1、IL-33在CRC組織中存在異常高表達,二者與腫瘤惡性生物學行為密切相關,且二者表達存在相關性。