MTHFD2在非肌層浸潤性膀胱癌中的表達及其臨床意義

朱景香 徐慧杰 吳鳳梅

膀胱癌(bladder cancer,BC)作為常見泌尿系統中的惡性腫瘤,臨床發病率高,死亡率也較高,對患者身體健康及生命安全造成極大危害[1]。BC可分為非肌層浸潤性膀胱癌(non muscle-invasive bladder cancer,NMIBC)及肌層浸潤性膀胱癌,其中NMIBC占比較大,且NMIBC會存在較大的復發可能性,不利于患者預后[2]。NMIBC治療方式以經尿道膀胱腫瘤電切術為主,但經過電切術治療后仍存在高復發可能性。亞甲基四氫葉酸脫氫酶2(MTHFD2)作為與BC疾病進展存在一定相關性的腫瘤標志物,在癌細胞增殖、侵襲方面具有重要的作用。本研究選取我院NMIBC患者作為研究對象,以探討MTHFD2在其中的表達及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院2019年6月至2020年7月NMIBC患者82例,男性49例,女性33例;單發腫瘤49例,多發腫瘤33例;WHO腫瘤分級I～II級55例,Ⅲ級27例;吸煙史41例,無吸煙史41例;腫瘤直徑1～4 cm,平均(2.29±0.13)cm。

1.2 選取標準

納入標準:①經病理檢查、膀胱鏡影像學檢查確診為NMIBC;②所有患者均接受經尿道膀胱腫瘤電切術治療;③術前未進行化療、放療等治療者。排除標準:①膀胱結石者;②合并其他腫瘤者;③免疫系統疾病者。

1.3 方法

免疫組化染色法檢測:手術中取癌組織及癌旁組織。所有實驗步驟嚴格遵循說明方法操作。在脫蠟前將標本切片置于溫度為37 ℃的烤箱內烘片,等待一夜,待組織和切片密切貼附。將組織切片放在溫度為37 ℃的二甲苯溶液內,進行15 min左右的浸泡,脫蠟后,將溶液替換后繼續浸泡15 min。將切片采用無水乙醇兩次、90%、80%、70%的乙醇各一次,將切片浸泡在其中5 min。進行蒸水兩次,將切片浸泡在其中5 min。使用濃度為3.3%過氧化氫,將切片浸泡10 min,再運用0.01%PBS緩沖液洗凈3次,每次5 min。使用羊血清液將切片封閉2 h,羊抗采用濃度為1%BSA封閉。在完成封閉后,開始一抗的配置,將血清擦凈后注入一抗,在環境為4 ℃下將切片孵育過夜。使用濃度為0.01%PBS緩沖液進行3次沖洗,5 min/次。配置二抗,反應1 h,將切片放置在37 ℃的烤箱中。采用濃度為0.01%PBS緩沖液進行3次沖洗,5 min/次。配制顯色液染液,進行避光儲存,于顯微鏡下染色處理,間隔一定時間后沖洗。采用蘇木精進行染核40 s,運用自來水沖洗20 min。使用1%的HCL對組織切片搖擺2次,水流沖洗10 min,通過鏡檢觀察染核狀況。將切片放置在通風櫥內,進行樹脂封片。采用37 ℃的烤箱進行烘烤。對組織行400×顯微照相。經由兩位病理醫師獨立閱片,當MTHFD2定位在線粒體中,則為胞漿染色,當其為深褐色或淺棕色時,則為陽性。參照組織著色的強度,給組織標本進行評分,按著色淺到深,記為0～2分。按照陽性細胞在總體細胞中的比例計算分值,<10%為1分,10%～50%為2分,>50%為3分。將組織染色的強度、陽性細胞分布得分的乘積視為MTHFD2的表達狀況。按照以上計算分值方法進行各個樣本計分,將總分值設為0～6分,其中<2分表示為陰性,≥2分為陽性。

1.4 觀察指標

(1)記錄MTHFD2 mRNA于BC、癌旁正常組織內的差異。(2)記錄MTHFD2 mRNA與病理分期、預后關系。(3)記錄MTHFD2 mRNA蛋白表達狀況和病理參數關系。(4)隨訪時間5年,記錄BC組織內MTHFD2蛋白表達和生存預后關聯。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 MTHFD2 mRNA于癌組織、癌旁正常組織內的差異

MTHFD2 mRNA在癌組織內表達水平較癌旁正常組織高。見圖1。

圖1 MTHFD2 mRNA在NMIBC癌組織及癌旁正常組織中的表達

2.2 MTHFD2與病理分期的關系

MTHFD2 mRNA于Ⅲ期、Ⅳ期患者組織中的表達對比Ⅱ期患者存在明顯增高趨勢。見圖2。

圖2 MTHFD2 mRNA在NMIBC各分期中的表達

2.3 MTHFD2 mRNA蛋白表達狀況和病理參數關系

82例患者中60例患者癌組織內MTHFD2蛋白表達為陽性,其陽性率為73.17%;其對應的癌旁正常組織內,存在14.63%表達為陽性。NMIBC組織內MTHFD2蛋白表達狀況和腫瘤數目、大小、病理分期等病理參數存在關聯(P<0.05)。見表1。

表1 MTHFD2 mRNA蛋白表達狀況和病理參數關系(例,%)

2.4 MTHFD2蛋白表達和生存預后關聯

MTHFD2蛋白陽性表達組患者術后無瘤生存時間[(36.45±2.39)個月]較陰性表達組[(49.36±2.46)個月]短(t=24.086,P<0.001)。

3 討論

BC作為臨床泌尿系統常見惡性腫瘤,主要受遺傳、環境等多種因素影響,也與慢性炎癥、化工染料等因素有關[3-4]。該病每年新發病例較多,且病死率較高,大部分患者為NMIBC[5]。臨床治療后大部分患者仍會出現腫瘤復發,預后情況較差。按照患者復發可能性、臨床預后情況的差異又能區別為低、中、高NMIBC。NMIBC患者缺乏及時有效治療,會侵襲固有層,存在高度異質性,在治療完成后仍會再次復發[6]。臨床上采取的外科手術療法,雖然能將腫瘤組織全部清除,可預后情況仍不夠理想。挑選合適的預測生物學標志物,有利于分辨患者預后狀況,予以針對性的有效治療[7-8]。采取有效的標志物檢測手段能在一定程度上規避癌癥復發的可能性,在將臨床上發現的腫瘤清除后,且能對腫瘤組織分級、評估分期,利于后續的治療計劃,實現控制癌癥進展的目的。MTHFD2作為一碳代謝關鍵酶,在多種腫瘤細胞組織內存在表達跡象,且其表達水平被認為和癌癥患者預后情況呈負相關關系[9]。

MTHFD2 mRNA在BC組織內表達水平較正常組織高,提示BC組織內MTHFD2 mRNA水平存在高表達狀況。可能原因在于,細胞凋亡作為細胞程序化死亡的過程,而MTHFD2作為參與細胞內葉酸代謝反應關鍵酶,同時葉酸又和細胞增殖活動存在緊密關聯,具備亞甲基四氫葉酸脫氫酶、環化水解酶雙重活性,能幫助葉酸代謝產物進行相互轉化。癌細胞中具備快速糖酵解、合成氨基酸等合成及代謝過程,能幫助癌細胞迅速增殖,其中受四氫葉酸輔助因子具備的單碳單元合成在癌細胞增殖中存在積極作用[10]。研究提示臨床癌癥分期較高者MTHFD2 mRNA水平也較高。分析原因在于,MTHFD2 mRNA是人類第二染色體上基因所編碼的線粒體酶,該基因對腫瘤細胞這類快速增殖的細胞來說具備極為重要的作用,能支持腫瘤細胞所需的高水平嘌呤合成[11]。受癌細胞的代謝特性影響,癌組織長期位于高濃度活性氧內,活性氧的大量增多會對細胞周期發生抑制作用,促細胞凋亡。MTHFD2經平衡葉酸代謝內的氧化還原,減少活性氧含量,阻斷癌細胞凋亡進程。在存在高度增殖的癌組織內,線粒體葉酸通路內MTHFD2 mRNA、蛋白表達水平均增高,且和患者預后不良存在關系[12]。本研究數據顯示,82例患者中,存在60例患者癌組織內MTHFD2蛋白表達為陽性,其陽性率為73.17%,其對應的癌旁組織內,存在14.63%表達為陽性,且BC組織內MTHFD2蛋白表達狀況和腫瘤數目、大小、病理分期等病理參數存在關聯(P<0.05)。分析原因在于,MTHFD2具備提高腫瘤細胞組織增殖、侵襲能力,能有效促進癌癥的產生、進展[13]。MTHFD2可在快速增殖的惡性腫瘤內過度表達,參與線粒體內一碳代謝、嘌呤合成,是癌組織快速增長的要素[14]。此外,本研究數據還顯示,MTHFD2蛋白陽性表達組患者術后無瘤生存時間較陰性表達組短(P<0.05),提示MTHFD2蛋白陽性表達者預后不良狀況更明顯。抑制MTHFD2表達能抑制癌細胞增殖,阻斷其發生轉移[15]。通過抑制MTHFD2在細胞內的表達,能有效延長患者預后生存周期。

綜上所述,NMIBC組織內MTHFD2水平的高表達提示患者可能存在預后不佳狀況,其可作為NMIBC臨床預后的潛在指標。