異基因造血干細胞移植患者淚液中IL-36的表達情況及其與眼表微環境的相關性分析

王仡寧,李德鵬,張 玲,黃小雨,陰小月,張照委,郭建新

0 引言

同種異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)是目前治療多種血液系統疾病最常見的治療方法[1]。但移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)仍是影響接受allo-HSCT患者成功率及威脅其預后最主要且最嚴重的并發癥,據統計約有40%～60%接受造血干細胞移植患者發生[2-3]。眼部移植物抗宿主病(ocular graft-versus-host disease,oGVHD)影響眼前段及眼后段,其中,最主要影響眼前節。對于oGVHD何時發生及其具體病理機制,尚不十分明確。現有的研究認為oGVHD發病與供體淋巴細胞相關,是T效應細胞自身免疫中樞失耐受的結果[4]。此外,還有研究認為oGVHD發病與T細胞亞群的改變、B細胞失調、細胞因子的改變等有關[5]。白細胞介素(interleukin,IL)因在免疫細胞的成熟、活化、增殖過程中發揮重要的免疫調節作用[6],因此,在IL水平進行監測及干預,對oGVHD進行診斷及治療十分重要。白細胞介素-36(interleukin-36,IL-36)是IL-1家族新成員,由3個生物學功能相似的分子IL-36α、IL-36β和IL-36γ組成[7]。近期,有研究發現,人白細胞抗原-B27(human leukocyte antigen-B27,HLA-B27)相關性急性前葡萄膜炎和特發性急性前葡萄膜炎患者的房水和血清中可發現改良的IL-1家族譜細胞因子,包括IL-36[8-9],且IL-36相關細胞因子被發現參與了纖維化的發病機制[10]。但是關于IL-36在oGVHD患者淚液中的表達水平及與患者臨床表現的相關性有待研究。因此,本研究對行allo-HSCT患者淚液中IL-36(α、β、γ)表達水平、眼表微環境各指標及聯合結膜印跡細胞學染色(CIC)進行動態監測及術后隨訪,為oGVHD的診斷及治療提供新的生物標志物。

1 對象和方法

1.1 對象本研究為前瞻性研究。選取2020-01就診于我院血液科,經血液科醫師確診的可行allo-HSCT的患者35例70眼,其中男21例,女14例,年齡18～52(平均35±9.73)歲。另選取年齡、性別相匹配的健康志愿者35例70眼作為正常對照組。本研究經徐州醫科大學倫理委員會批準(批件號:XYFY2020-KL020-01),受試者均簽署知情同意書,受試者、項目參與人仔細閱讀知情同意書后,簽名并注明日期。

1.1.1 納入標準(1)就診于我院血液科,經血液科醫師確診的可行allo-HSCT的患者;(2)年齡≥18歲;(3)雙眼前節無異常;(4)未經過任何眼部治療。

1.1.2 排除標準(1)在納入研究前6mo給予外用治療,包括外用類固醇、環孢素、治療性隱形眼鏡使用;(2)存在眼表疾病,如干眼(dry eye,DE)、結膜炎、角膜炎、淚道、淚腺疾病;(3)存在其他眼部疾病及其可能影響眼表狀態,包括高度近視、高眼壓癥、青光眼和視網膜疾病;(4)合并其他全身疾病影響眼表穩態者,包括糖尿病、干燥綜合征、系統性紅斑狼瘡、銀屑病;(5)進行過任何眼部手術;(6)存在精神系統疾病或配合不佳或拒絕參加者;(7)絕經期女性。

1.2 方法正常對照組及allo-HSCT患者在移植開始前7～9d和allo-HSCT后3、6、9mo均接受了全面的眼科檢查,包括視力、眼壓、裂隙燈檢查眼表、散瞳檢查眼底。每次就診前使用眼表疾病指數(ocular surface disease index score,OSDI)量表對眼部不適的主觀癥狀進行評分,同時對患者進行眼表微環境相關檢查[包括淚液分泌試驗(Schirmer試驗)、角膜熒光素鈉染色(cornea fluorescein staining,FL)[11]、淚膜破裂時間(tear break-up time,TBUT)]、結膜印跡細胞學染色(conjunctival impression cytology,CIC)觀察結膜杯狀細胞與結膜上皮細胞[12-13],采用改良Nelson分級對其進行評分[14],以及使用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測淚液中炎性因子IL-36(α、β、γ)的表達情況。根據國際眼部移植物抗宿主病共識工作組標準(International Chronic Ocular Graft-versus-Host-Disease Consensus Group,ICCGVHD)與國際淚膜和眼表協會干眼工作組第二次會議(Tear Film and Ocular Surface Society Dry Eye Workshop Ⅱ,TFOS DEWS Ⅱ),分別由血液學科醫生和眼科醫生做出全身性和眼部GVHD的診斷[15],該標準基于Schirmer試驗、角膜染色、結膜染色、干眼癥狀和系統性GVHD的存在。考慮GVHD可能累及多系統多組織,本研究根據德國/奧地利/瑞士慢性移植物抗宿主病(cGVHD)臨床實踐共識會議(German/Austrian/Swiss Consensus Conference on Clinical Practice in cGVHD,GAS CC)標準對其進行疾病分級[16-17]。在每次就診期間,告知患者眼部GVHD的發生率和潛在的嚴重后遺癥,以及眼部干澀不適、光敏感、流淚、異物感、疼痛、發紅、腫脹、分泌物增多或視力下降等警告信號。對患者隨訪9mo,在隨訪過程中,當檢查患者眼表出現異常時,即使患者沒有臨床癥狀,應對其進行治療。

1.2.1Schirmer試驗在無眼表麻醉下進行,囑患者靜坐,采用淚液檢測濾紙,末端折疊5mm,輕輕置于下瞼結膜中外1/3交界處,盡量避免刺激角膜引起反射性淚液分泌,囑患者閉眼5min,取出濾紙靜置2min后觀察,觀察濾紙浸潤長度。濾紙浸潤長度<10mm為輕度,<5mm為中度,<2mm為重度。

1.2.2TBUT和FL 將1μL 2%熒光素鈉液體滴入結膜囊后眨眼3次,以s為單位記錄TBUT,即自最后一次瞬目后睜眼至角膜出現第一個黑斑記錄時間,正常>10s,5s

1.2.3CIC 將醋酸纖維濾膜預先剪成直邊為4mm×6mm×9mm大小的梯形備用。鹽酸奧布卡因滴眼液點眼1次,5min后,用棉簽吸去穹窿部淚液。將其粗糙面貼于顳下側角膜緣外1mm處的球結膜表面,輕輕加壓,用玻棒輕輕按壓3～5s后用無齒鑷將濾紙從尖端小心剝離。95%酒精固定10～30min,4℃冰箱保存[14]。采用PAS聯合蘇木素染色法。各組分析眼表結膜上皮鱗狀化生程度及杯狀細胞密度,采用改良Nelson分級。

1.2.4 淚液中炎癥因子IL-36三種亞型水平檢測淚液取樣:用Schirmer條取樣淚液。將濾紙以直角折疊并使用鑷子放置在下穹窿內測2/3和外側1/3之間,然后將其放置在0.2mL EP管中,收集后立即儲存在-80℃下。提取淚液[19]:將濕潤長度的條帶剪成碎片后加入200μL磷酸鹽緩沖液(PBS),離心震蕩1h后取100μL上清液保存在聚丙烯管中置于-80℃冰箱保存。兩眼的淚液混合在一起,采用ELISA(試驗程序遵循制造商的說明)測定淚液中IL-36α、IL-36β、IL-36γ水平。所有定量數據均行3次取平均值,所有檢查與標本取樣均由同一名經驗豐富的眼科醫師完成。

2 結果

2.1 一般情況受檢患者的清髓調理方案:白血病包括:羥基脲40mg/kg,阿糖胞苷2.0g/m2,白舒非0.8mg/kg,環磷酰胺1.8g/m2,司莫司汀250mg/m2,即復寧2.5mg/kg;再生障礙性貧血包括:氟達拉濱30mg/m2,環磷酰胺30mg/kg,即復寧3.75mg/kg。調理方案的選擇基于患者的年齡、既往治療、共病和惡性腫瘤的狀態。所有患者均接受甲氨蝶呤和霉酚酸酯預防GVHD。

研究期間5例因病情加重去世,6例失訪,共納入24例48眼allo-HSCT患者,其中男10例,女14例,年齡18～52(平均34.04±9.15)歲;正常對照組35例70眼,其中男17例,女18例,年齡18～48(平均33.34±8.47)歲,兩組年齡、性別比較差異均無統計學意義(P>0.05)。對24例完成術前及術后3次隨訪的患者進行眼表參數和生化參數的統計分析見表1。

表1 24例allo-HSCT患者的基本信息

2.2 炎癥因子IL-36三種亞型水平分析

2.2.1 術前allo-HSCT組與正常對照組IL-36三種亞型水平比較使用ELISA檢測各組受檢者淚液中IL-36(α、β、γ)的表達水平結果顯示,與正常對照組相比,allo-HSCT組IL-36(α、β、γ)術前基線表達水平更高,其中,無論在正常對照組還是allo-HSCT組,以IL-36γ表達水平最高,見表2。

表2 術前allo-HSCT組與正常對照組IL-36三種亞型水平比較

2.2.2oGVHD組與Non-GVHD組不同時點IL-36三種亞型水平比較allo-HSCT組受檢者術后隨訪3次,每3mo 1次,對術后是否出現眼部癥狀的受檢者分為oGVHD組(8例)和非oGVHD(Non-oGVHD,16例)組。兩組間不同時點IL-36(α、β、γ)水平經雙因素重復測量方差分析結果顯示,IL-36α、IL-36β在不同時點、分組、時點與分組的交互效應上均有統計學意義(IL-36α:F時點=47.018,F分組=325.416,F時點×分組=45.600,均P<0.01;IL-36β:F時點=103.606,F分組=107.577,F時點×分組=98.052,均P<0.01),IL-36γ在不同時點上有統計學意義(F=4.491,P=0.019),在不同分組、時點與分組的交互效應上無統計學意義(F分組=2.975,P分組=0.099;F時點×分組=3.138,P時點×分組=0.058),見表3。

表3 不同時點oGVHD組和Non-oGVHD組淚液中IL-36三種亞型水平比較

2.2.3oGVHD組和Non-oGVHD組組內不同時點淚液中IL-36三種亞型水平比較Non-oGVHD組組內不同時點IL-36α、IL-36β、IL-36γ兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。oGVHD組組內不同時點IL-36三種亞型水平兩兩比較結果顯示,術后6、9mo時IL-36α、IL-36β均明顯高于術前、術后3mo;術后9mo時IL-36α、IL-36β均明顯高于術后6mo;術后3mo時IL-36β明顯高于術前。術后6、9mo時的IL-36γ均明顯高于術前,差異均有統計學意義(P<0.05),見表3。

2.2.4oGVHD組和Non-oGVHD組組間不同時點淚液中IL-36三種亞型水平比較術前,術后3、6、9mo,oGVHD組與Non-oGVHD組IL-36γ比較,差異無統計學意義(t=0.377,P=0.710;t=1.717,P=0.100;t=2.018,P=0.056;t=2.827,P>0.05);術前,術后3、6、9mo,oGVHD組IL-36α、IL-36β均明顯高于Non-oGVHD組,差異有統計學意義(IL-36α:t=4.111,P=0.001;t=4.374,P<0.001;t=12.517,P<0.001;t=9.925,P<0.001;IL-36β:t=2.216,P=0.037;t=4.497,P<0.001;t=9.080,P<0.001;t=12.225,P<0.001),見表3。

2.2.5 術后oGVHD組受檢者淚液中IL-36三種亞型與臨床參數的相關性在所有研究對象和對照對象中,觀察到雙眼的臨床參數與眼部癥狀相似,8例oGVHD患者的眼表損害程度均為輕度,CIC結果見圖1,Nelson分級為0～2級。故本研究記錄了兩只眼睛眼表參數的平均值與受檢者術后淚液中IL-36(α、β、γ)的水平,采用Pearson相關性分析對各指標間的相關性進行分析顯示,oGVHD患者淚液中IL-36(α、β、γ)表達水平與眼表參數具有相關性。術后3mo時,IL-36β與FL不具有相關性(r=0.707,P=0.050),IL-36γ與TBUT呈正相關(r=0.775,P=0.024);術后6mo,IL-36α與TBUT不具有相關性(r=-0.635,P=0.091)。其余隨訪時間,IL-36(α、β、γ)與OSDI評分、FL、CIC呈正相關,與TBUT、Schirmer試驗呈負相關(均P<0.05),見表4。

圖1 CIC圖片 A:正常,結膜上皮細胞小而圓,細胞間連接緊密,杯狀細胞>500/mm2,形態大而圓;B:1級,輕度鱗狀上皮化生,結膜上皮細胞較大,細胞間距較0級大,細胞大,核小,杯狀細胞350～500/mm2,形態較0級無明顯變化;C:2級,中度鱗狀上皮化生,結膜上皮細胞大,分辨差,細胞間距更大,細胞核小,杯狀細胞嚴重減少100～350/mm2。

表4 oGVHD組受檢者術后淚液中IL-36三種亞型與臨床參數的相關性分析

3 討論

GVHD為allo-HSCT術后的常見并發癥,根據美國國立衛生研究院(National Institutes of Health,NIH)的共識標準,以往根據臨床癥狀的發病時間將移植物抗宿主病分為急性或慢性[20-21]。然而,在2005年,NIH發布共識表示根據臨床表現來定義急性和慢性移植物抗宿主病[22]。cGVHD較多見,通常發生在病程晚期,常累及多器官系統,致殘率和致死率均較高,是影響HSCT治療效果的主要障礙[23-24]。眼部是cGVHD主要靶器官之一。眼部受累的常見表現可與DE相似。但是oGVHD臨床癥狀較普通DE更為復雜,顯著影響患者的視力和生活質量[25]。

oGVHD的發病機制尚不十分明確,根據oGVHD目前研究得出的發病機制,炎癥是DE發生的核心,減輕眼表的炎癥是其治療中必不可少的一步,如環孢素滴眼液有益于抗炎治療[26]。在GVHD患者中,正確識別眼部受累對于全身性疾病嚴重程度的評估也至關重要,迄今為止,眼科醫生尚無眼部特異性生物標志物。

CIC是一種簡單易行的眼表細胞學檢查方法,主要通過檢查眼表疾病中結膜上皮杯狀細胞的改變及鱗狀上皮化生程度,分析眼表上皮細胞的病理學改變。本研究通過CIC觀察allo-HSCT患者的結膜上皮細胞、結膜杯狀細胞,發現oGVHD患者有不同程度的鱗狀上皮化生、杯狀細胞密度減少,這些可能是影響淚膜層穩定性的重要因素,并且杯狀細胞的密度可能反映了眼表面的整體健康狀況,這與Kinoshita等[27]研究者觀點一致。并且有研究表明oGVHD患者主要靶組織是結膜與淚腺,并發現結膜纖維化的病理改變與其臨床表現有關[28],一旦由于眼表面上的微環境(包括杯狀細胞,其除了產生黏蛋白外還具有免疫調節功能)的紊亂而導致內環境穩定失調,眼表面就變成免疫高級部位[29]。對于allo-HSCT術后于眼科隨訪的患者,應對其進行CIC檢查,進一步評估其眼表狀態。

近年來,國內外學者對oGVHD患者淚液中IL因子表達水平進行檢測,以求發現與oGVHD發病相關的生物標志物,用于預測oGVHD的發生及早期治療干預。研究發現,IL-1β、IL-6、IL-8、IL-7在oGVHD患者淚液中表達增高,并與患者臨床嚴重程度相關[30]。此外,Sridevi等同樣發現與Non-oGVHD和健康對照相比,oGVHD患者淚液中IL-6,IL-8,IL-10,IL 12AP70,IL-17A等細胞因子表達升高[19]。IL-36是新發現的一類細胞因子,IL-36細胞因子家族是IL-1家族的一部分。由IL-36α、IL-36β、IL-36γ和天然的拮抗劑IL-36Ra組成[31],主要分布在皮膚、肺臟、關節、腸道、腎臟和大腦中,可由單核/巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、角質細胞、M2細胞、朗格漢斯細胞等多種細胞產生[32]。據報道,IL-36γ在銀屑病、炎性腸病、關節炎、系統性紅斑狼瘡等多種炎性疾病動物模型和患者體液中也被報道表達增高,并能促進IL-17、IL-20、IL-22、IL-23、TNF和IFN-γ等炎癥因子產生,這些證據均提示IL-36是一類“促炎細胞因子”[31,33-35]。

本研究發現,與正常對照組和Non-oGVHD組相比,oGVHD患者淚液中IL-36(α、β、γ)顯著升高,以IL-36(α、β)更明顯,且在兩組間不同時點IL-36(α、β)表達具有統計學意義,可能因為IL-36γ在術前已呈高表達,而在眼表微環境受損的情況下升高趨勢不明顯,這與Li等[36]研究者發現一致。allo-HSCT患者IL-36(α、β、γ)術前基線表達水平較正常對照組較高,這可能提示我們,原發疾病致機體免疫功能受損對IL-36(α、β、γ)的表達可能存在影響。對oGVHD組患者術后IL-36(α、β、γ)的表達水平與眼表參數進行分析,結果顯示,IL-36細胞因子表達水平與OSDI評分、FL、CIC呈正相關,與TBUT、Schirmer試驗呈負相關。如前所述,IL-36是一類促炎細胞因子,根據此次研究結果,oGVHD眼表微環境受損可能與其異常表達有關;無相關性臨床參數與樣本量偏少有關。本研究發現,在oGVHD眼部癥狀出現之前,IL-36(α、β、γ)因子已出現高表達,隨時間推移呈現增高趨勢,且與Non-oGVHD組有統計學意義,且與臨床眼表參數有相關性,這可能提示我們,在oGVHD眼表不適癥狀出現之前,眼表穩態結構可能已被破壞;IL-36細胞因子可能是oGVHD的早期敏感指標。

IL-36在許多器官/組織(包括皮膚、肺和腸道)中表達及其受體參與炎癥反應[37]。在上皮細胞和特異性免疫細胞上觀察到IL-36上調,誘導細胞進一步激活和分泌細胞因子和趨化因子,導致多種免疫細胞募集和激活[38]。在急性葡萄膜炎的房水中檢測到高度升高,與自身反應性T細胞免疫反應有關[8],表明IL-36參與了針對致病性入侵的宿主免疫的發展。本研究觀察到oGVHD的淚液中IL-36(α、β、γ)升高。盡管oGVHD的發病涉及非感染性原因,但本研究數據表明,oGVHD的發病機制與微環境中的宿主免疫介導的炎癥有關。此外,我們發現IL-36和眼表微環境參數之間存在相關性,這進一步支持了IL-36可能參與了oGVHD發病機制。

綜上,本研究認為檢測淚液中IL-36細胞因子對allo-HSCT后oGVHD的診斷有重要意義;警醒我們定期隨訪allo-HSCT手術的患者,即使他們沒有眼部癥狀。本研究中樣本數量相對較少,無法全面研究不同嚴重程度oGVHD各臨床變量的差異。另外,未來可進一步研究IL-36細胞因子與已證實在oGVHD患者淚液中有診斷價值的炎癥因子的關系。