超高效液相串聯質譜法測定牛奶中8 種氟喹諾酮類獸藥殘留

張瑞婷

（北京市產品質量監督檢驗研究院，北京 101300）

氟喹諾酮類藥物為白色或淡黃色晶型粉末，屬于廣譜抗生素，常被用于預防和治療奶牛疾病[1]。獸藥的過量使用或不當使用與公眾的健康息息相關，長期、低水平的接觸方式不僅導致細菌產生耐藥性，還會產生各種慢性、蓄積性毒害，給消費者帶來潛在危險。因此，建立獸藥殘留的分析方法對于風險監控是十分必要的[2]。目前，獸藥殘留量的檢測方法主要有金標檢測法、酶聯免疫吸附法、高效液相色譜法、氣相色譜法和質譜法等[3]。超高效液相串聯質譜法的優點是選擇性強、應用范圍廣、分離效果好、靈敏度高和能自動化操作[4]。其可以把待測組分分離與結構的定量分析有機結合在一起，特別適用于藥物殘留量和藥物的確證分析[5]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相串聯質譜儀（Waters 公司）；氮吹濃縮儀（Organomatian Associates 公司）；冷凍離心機（Sigma 公司）；Oasis HLB 固相萃取柱（200 mg，6 mL，Waters 公司）。

8 種喹諾酮類獸藥標品：恩諾沙星、諾氟沙星、環丙沙星、司帕沙星、氧氟沙星、奧比沙星、萘啶酸和噁喹酸，均購于德國DR 公司；乙腈、甲醇、正己烷和甲酸（HPLC 級）；超純水（Mili-Q 公司）。

1.2 溶液的配制

1.2.1 標準儲備溶液

精密稱量各種藥品標準品10 mg（精確到0.1 mg）于10 mL 容量瓶（棕色）中，用乙腈超聲溶解并定容至刻度（其中噁喹酸需加少量NaOH 溶液溶解），配制成1.0 mg·mL-1標準儲備溶液，4 ℃冰箱避光保存。

1.2.2 混標工作溶液

取洗凈烘干的50 mL 棕色容量瓶，加入500 μL儲備液，乙腈定容至刻度，配制成濃度為10.0 μg·mL-1的混標中間溶液，置于4 ℃冰箱冷藏避光保存。

1.2.3 流動相

0.3 %甲酸水溶液：準確吸取3 mL甲酸至1 000 mL容量瓶，用超純水定容至刻度，現配現用。流動相：乙腈∶0.3%甲酸=10 ∶90。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

將牛奶樣品輕晃混勻后稱取5.00 g（精確到0.01 g），裝入50 mL 的PP 管中，依次加入無水硫酸鈉5 g，1%的甲酸-乙腈溶液20 mL，輕柔渦旋混勻，充分反應。超聲波提取時，保持處于冰浴環境中，離心轉速5 000 r·min-1，時間5 min，之后取上清液于另一潔凈的離心管中。將剩余殘渣重復一次上述操作，取上清液。吸取10 mL 提取到的上清液，加入20 mL 乙腈飽和的正己烷，振蕩靜置分層棄去正己烷層，氮氣吹至近干。

1.3.2 凈化

HLB 固相萃取柱（200 mg，6 mL）使用前用6 mL甲醇洗滌、6 mL 水凈化，將提取的上清液以2 ～3 mL·min-1的速度過柱，過兩次后棄去濾液，用2 mL 5%的甲醇溶液淋洗，棄去淋洗液，減壓真空泵抽取5 min，在吸附柱中加入5 mL 甲醇洗脫液，5 000 r·min-1離心1 min，將收集到的洗脫液在氮氣下吹至近干后，加入1 mL流動相溶液溶解，經0.22 μm微孔濾膜過濾，以備上機分析測定使用。

1.4 測定條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm BEH 顆粒，美國沃特世公司）；流動相：A 相為乙腈，B 相為0.3% 甲酸水溶液；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣體積：5 μL。

1.4.2 質譜條件

離子源：電噴霧電離-正離子模式（ESI+）；檢測方式：MRM（多反應監測）；毛細管電壓：3.5 kV；脫溶劑氣流量：800 L·h-1；錐孔氣流量：120 L·h-1；碰撞氣：氬氣；碰撞氣壓：0.18 Pa。

2 結果與分析

2.1 提取劑的選擇

在酸性提取溶劑中，氟喹諾酮類藥物更容易被萃取；乙腈屬于極性溶劑，可避免從樣品中提取過多的脂肪，同時具有很好的蛋白沉積效果，可沉積樣品中99%的蛋白，避免其他雜質的干擾。因此，初步確定采用乙腈為提取溶劑。

本實驗對純乙腈、1%乙酸-乙腈、1%甲酸-乙腈3 種提取劑提取效果進行了對比，結果顯示酸化乙腈提取效果更佳。其中1%甲酸-乙腈、1%乙酸-乙腈的提取效果相差不大，但1%甲酸-乙腈提取后的色譜峰更加尖銳，故確定最終提取溶劑為1%甲酸-乙腈。

2.2 流動相的選擇及質譜條件的優化

以不同比例的乙腈-水為流動相進行梯度洗脫時，為了提高正離子化效率并改善峰形，同時考慮到分析組分中大多含有氨基和羧基基團，所以分別嘗試了在水相中加入0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.3%甲酸、5 mmol·L-1甲酸銨、10 mmol·L-1甲酸銨進行洗脫。對比結果顯示，流動相中加入0.3%甲酸時，樣品由結合態變為游離態，靈敏度高，分離效果好。

質譜參數的優化是通過ESI 探針分別將8 種獸藥（濃度1 mg·L-1）的混合標準品工作液在正電離模式下用質譜蠕動泵自動進樣，對每一種獸藥進行母離子全掃描確定各種待測獸藥的分子離子，而后取其分子離子為母離子，對其進行全掃描。選取豐度最強、干擾最小的兩個離子用于目標分子的定量和定性分析，表1 為8 種獸藥質譜分析優化參數。

表1 8 種獸藥質譜分析優化參數

2.3 線性范圍及檢出限

將8 種待測獸藥配制成一系列標準工作溶液，繪制標準工作曲線，對目標物質進行定量分析。分別得到待測獸藥的標準曲線回歸方程、定量限及相關系數，結果表明在0.5 ～500.0 μg·mL-1，R2＞0.996，8 種獸藥的回歸方程均線性良好。通過逐級稀釋，根據信噪比（S/N）等于10 確定為定量下限，結果見表2。

表2 8 種獸藥的線性方程、相關系數

2.4 回收率與精密度

在待測樣品中添加8 種獸藥的混標工作溶液，分別在10 μg·kg-1、50 μg·kg-1、100 μg·kg-13 個濃度水平下進行回收率實驗，同時每個濃度水平下進行6次平行實驗，計算精密度。結果見表3。結果顯示，該方法的平均回收率為81.3%～98.8%，RSD 為2.3%～9.8%，表明本方法的回收率和RSD 均在標準范圍內，符合多殘留分析的要求。

表3 牛奶中8 種獸藥的回收率與精密度

2.5 實際樣品檢測

在市場上隨機購買15 份不同批次牛奶樣品，經檢測發現1 份陽性樣品。恩諾沙星檢出值12.1 μg·kg-1，其他藥物無檢出。該例陽性樣品獸藥殘留量未超過GB 31650—2019 規定的最高殘留限量，可認為是合格樣品。

3 結論

本實驗建立了一種簡單、靈敏、快速的8 種獸藥殘留分析方法，通過對凈化方法、流動相、質譜條件等一系列實驗條件的探索優化，建立了UPLCMS/MS 同時檢測牛奶中8 種氟喹諾酮類獸藥的分析方法。該方法克服了檢測種類少、檢測時間長、實驗成本高等問題，適用于牛奶樣品多殘留的快速篩查和檢測。