表達狂犬病病毒糖蛋白穩轉細胞株的構建與應用

李海倫, 龔志遠, 焦翠翠, 王福江,黃靜波, 白玉潔, 黃 培, 張海麗, 李媛媛, 王化磊*

(1.吉林大學 動物醫學學院 人獸共患病研究教育部重點實驗室,吉林 長春 130062;2. 濰坊市畜牧業發展中心,山東 濰坊 262199)

狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus,RABV)感染引起的中樞神經系統人獸共患傳染病,對寵物健康和公共衛生安全構成重大威脅。一些國家的狂犬病防控經驗表明,動物疫苗免疫是控制人間狂犬病最經濟有效的方法。世界衛生組織(World Health Organization,WHO)呼吁全球在2030年前消滅由犬傳播的人間狂犬病。常見的動物用狂犬病疫苗主要分為弱毒活疫苗、滅活疫苗、基因工程疫苗3類。弱毒活疫苗容易毒力返強,并對免疫缺陷動物等存在潛在感染風險[1],目前在我國已經被禁止生產和使用[2],在國外主要用于野生動物的口服免疫。當前應用較為廣泛的動物疫苗多為滅活疫苗,但其仍存在成本高和免疫效果不夠持久的不足。因此研制安全、高效的基因工程疫苗對于狂犬病的綜合防控具有重要意義。

RABV基因組編碼5種結構蛋白質,分別是核蛋白(nucleoprotein,N)、磷蛋白(phosphoprotein,P)、基質蛋白(matrix protein,M)、糖蛋白(glycoprotein,G)和依賴RNA的RNA多聚酶蛋白(RNA polymerase,L)[3]。G蛋白是唯一存在于RABV粒子表面的蛋白,是RABV的主要保護性抗原,能誘導機體產生體液免疫應答和細胞免疫應答,還參與介導病毒與細胞受體的結合,在病毒致病性和嗜神經性中發揮重要作用[4-5]。G基因缺失的RABV因缺乏病毒傳播或感染需要的元件,被稱為“復制缺陷型”RABV。復制缺陷型RABV在細胞內能完成一次生命周期,但不能產生子代病毒,因此安全性要優于其他疫苗[6]。此外,復制缺陷型RABV可作為疫苗載體,為研制安全、高效的復制缺陷型活載體疫苗提供了新的思路。本研究擬構建穩定表達RABV-G基因的穩轉細胞株,為復制缺陷型RABV的高效增殖和狂犬病新型疫苗的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑真核表達載體YHM-Cas9-SP、Piggy Bac轉座子酶輔助質粒、pcDNA3.0-SRV9-G重組質粒、BSR細胞等均保存于吉林大學人獸共患病研究教育部重點實驗室病毒病研究室;AgeⅠ、BsrGⅠ限制性內切酶、T4DNA連接酶均購自NEB公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒均購自Axygen公司;Primer STAR Max DNA Polymerase購自北京寶日醫生物技術公司;DH5α感受態細胞、DNA Marker、SOC培養基均購自TaKaRa公司;去內毒素質粒小量提取試劑盒為QIAGEN公司產品;DMEM培養液、0.25%胰酶和胎牛血清均為Gibco公司產品;Polyjet脂質體轉染試劑購自Invitrogen公司;預染蛋白Marker購自Thermo公司;細胞膜染料DIO和鼠源抗RABV-G單克隆抗體購自Merck公司;TRITC標記的山羊抗小鼠IgG購自Abcam公司;HRP標記的山羊抗鼠IgG和FITC標記的山羊抗鼠IgG購自Bio World公司;滅瘟素S鹽酸鹽(blasticidin)購自大連美侖生物技術有限公司;MinuteTM質膜蛋白和細胞組分分離試劑盒購自Invent公司。

1.2 RABV-G表達載體的構建

1.2.1RABV-G基因的擴增 根據GenBank中公布的RABV SRV9株(GenBank:AF499686.2)G基因序列,分別設計RABV-G基因的PCR擴增引物,上游引物F:5′-ATAACCGGTATGGTTCCTCAGGCTCTCC-3′,下游引物R:5′-ATATGTACATTACAGTCTGGTCTCACCCCC-3′。以pcDNA3.0-SRV9-G質粒為模板,通過PCR擴增RABV SRV9 G基因。PCR擴增體系:上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL,模板200 ng,Primer STAR 25 μL,加ddH2O補充至50 μL。PCR反應條件:98℃ 1 min;98℃ 10 s,55℃ 10 s,72℃ 20 s,35個循環;72℃ 7 min。擴增完成后,產物經1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶。

1.2.2重組質粒的構建 將YHM-Cas9-SP載體和目的基因RABV-G用AgeⅠ、BsrGⅠ內切酶酶切,酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定,回收目的條帶(酶切后YHM載體)與RABV-G目的基因按一定比例于16℃連接過夜。將連接產物轉化至DH5α感受態細胞,培養12～16 h后,挑取單克隆菌落,擴大培養后提取質粒雙酶切鑒定正確后送生工測序鑒定。將鑒定正確的重組質粒命名為YHM-SRV9-G。

1.3 RABV-G蛋白的表達將BSR細胞接種于96孔細胞培養板中,待細生長至底面積的70%～80%時進行轉染,具體步驟:向無菌離心管中加入15 μL DMEM細胞培養液、0.5 μL Polyjet脂質體轉染試劑以及0.2 μg YHM-SRV9-G后輕輕混勻,室溫孵育15～20 min,然后將上述混合液緩慢加至96孔板培養的BSR細胞中,于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養,6 h后換新鮮培養基。轉染后48 h棄掉細胞上清,用80%冷丙酮室溫固定30 min;棄去液體用PBST清洗3次,使用1%BSA稀釋鼠抗RABV-G單克隆抗體(1∶500),37℃孵育1 h;棄去液體用PBST清洗3次,使用含1%BSA 1∶200倍稀釋的FITC標記的山羊抗鼠IgG抗體(含1∶500倍稀釋的伊文思藍),37℃孵育1 h;棄去液體用PBST清洗3次,置倒置熒光顯微鏡下觀察熒光信號。

1.4 穩轉細胞株的構建及鑒定

1.4.1Blasticidin對BSR細胞的毒性測定 將處于對數生長期的BSR細胞經胰酶消化,按照3×105個/孔接種至6孔板中, 37℃、5% CO2的培養箱中培養12 h后棄掉細胞培養上清,分別換成含0,5,10,20,30 mg/L blasticidin的培養基,每天觀察細胞死亡情況,適時更換含有blasticidin、10%胎牛血清的 DMEM培養基,每日觀察細胞生長狀態。連續培養1周后,選擇能使細胞形態未發生明顯變化且密度達到70%～80%的質量濃度作為最適篩選質量濃度。

1.4.2穩轉細胞株的構建 將BSR細胞接種于6孔細胞培養板中,待細胞密度達70%～80%時,向無菌離心管中加入50 μL DMEM細胞培養液、5 μL Polyjet脂質體轉染試劑、1 μg表達RABV-G基因的重組質粒以及1 μg Piggy Bac轉座子酶質粒后輕輕混勻,在室溫下孵育15～20 min,然后將上述混合液緩慢加至BSR細胞的培養液中,混勻,于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養,6 h后換新鮮培養基。轉染24 h后,加入20 mg/L的blasticidin進行藥物篩選。培養2周后,對細胞板中的細胞進行有限稀釋,接種于96孔細胞培養板,添加20 mg/L的blasticidin,繼續對細胞進行擴增篩選,直至部分細胞生長成簇,再次利用有限稀釋法進行單克隆篩選,如此經2次單克隆純化后,獲得能在blasticidin作用下穩定生長的單克隆細胞株,鑒定正確后擴大培養并凍存細胞。

1.4.3穩轉細胞株的PCR鑒定 按照試劑盒說明提取穩轉細胞株BSR-G和正常BSR細胞的基因組,進行PCR擴增。PCR擴增體系:上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL,模板200 ng,Primer STAR 25 μL,加ddH2O補充到50 μL。PCR反應條件:98℃ 1 min;98℃ 10 s,55℃ 10 s,72℃ 20 s,35個循環;72℃ 7 min。

1.4.4間接免疫熒光鑒定 利用間接免疫熒光(indirect immunofluorescence assay,IFA)鑒定細胞株中BSR-G的表達情況。將BSR-G細胞以合適的細胞密度接種于96孔細胞培養板中,48 h后用80%冷丙酮室溫固定30 min;棄去液體用PBST清洗3次,用含1%BSA的PBST 1∶500倍稀釋的鼠抗RABV-G蛋白單克隆抗體37℃孵育1 h;用含1%BSA的PBST 1∶200倍稀釋的FITC標記的山羊抗鼠IgG抗體(含1∶500倍稀釋的伊文思藍)37℃孵育1 h;棄去液體用PBST清洗3次,置于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光信號。

1.4.5激光共聚焦鑒定 將BSR-G細胞傳代,按2×104個/孔加入已放置細胞爬片的24孔細胞培養板中,37℃溫箱中培養36～48 h后用4%多聚甲醛孵育20 min固定細胞,用PBS沖洗3次,加入含1% BSA的PBS室溫封閉30 min;用封閉液1∶500倍稀釋鼠抗RABV-G單克隆抗體,37℃孵育1 h;用封閉液1∶500倍稀釋TRITC標記的抗鼠IgG 抗體,37℃孵育1 h。用PBST洗滌3次后,用50 μmol/L 的細胞膜綠色熒光探針(DIO)37℃孵育15 min;用PBST洗滌3次后,將含DAPI的抗熒光淬滅劑滴于爬片中央,3～5 min后,用90%甘油封片,使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。

1.4.6Western blot鑒定 將BSR-G細胞傳代,按MinuteTM質膜蛋白和細胞組分分離試劑盒說明書提取細胞膜成分,用裂解液進行裂解,經 5×loading buffer 處理后進行10% SDS-PAGE,電泳后將蛋白轉移至NC膜,加入用封閉液1∶500倍稀釋的鼠抗RABV-G蛋白單克隆抗體37℃孵育1.5 h,加入使用封閉液1∶10 000倍稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG(H+L),37℃孵育1 h,PBST沖洗3次后,加入顯色液進行顯影。

1.5 穩轉細胞株遺傳穩定性的鑒定為了驗證BSR-G細胞株中RABV-G蛋白表達的穩定性,將細胞進行連續傳代培養, F2、F8及F15代細胞傳代時留取部分細胞進行IFA鑒定。

1.6 G基因缺失重組狂犬病病毒rSRV9-△G-eGFP在穩轉細胞株中的增殖將BSR-G細胞和正常BSR細胞按合適的密度接種至24孔板,500 μL/孔。將G基因缺失的重組病毒rSRV9-△G-eGFP按MOI = 0.2分別接種單層BSR-G細胞和單層BSR細胞,37℃、5% CO2培養箱培養,分別于病毒感染后每24 h 通過重組病毒帶有的綠色熒光信號蛋白eGFP的表達來觀察病毒在穩轉細胞株和正常細胞中的增殖情況。每24 h收取1次病毒,測定病毒半數細胞感染量(50% tissue culture infectious dose,TCID50),并繪制病毒增殖曲線。

2 結果

2.1 重組質粒的鑒定RABV-G的PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳,得到1 575 bp特異性條帶,與預期大小一致。將RABV-G克隆至YHM載體,用AgeⅠ、BsrGⅠ內切酶進行酶切鑒定。酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析后,得到7 173 bp的載體片段和1 575 bp的目的基因條帶,與預期大小一致(圖1)。測序結果顯示,基因片段與目的基因序列一致,表明成功構建了含有RABV-G基因的重組質粒,命名為YHM-SRV9-G。

M.Marker;1.YHM-SRV9-G質粒的雙酶切產物

2.2 RABV-G蛋白的表達為鑒定G蛋白是否表達,將重組質粒YHM-SRV9-G、空載體質粒分別轉染BSR細胞,轉染后48 h以鼠抗RABV-G單克隆抗體作為一抗進行IFA鑒定。結果顯示,轉染YHM-SRV9-G質粒的細胞可檢到特異性熒光,表明重組質粒YHM-SRV9-G可在細胞中成功表達RABV-G蛋白(圖2)。

A.重組質粒YHM-SRV9-G;B.空載體質粒YHM-spCas9

2.3 穩轉細胞株的篩選及鑒定使用含不同質量濃度blasticidin的培養液培養BSR細胞,通過顯微鏡觀察細胞的生長狀態(圖3),培養1周后,blasticidin質量濃度為20 mg/L時細胞仍可達到70%～80%密度,且細胞形態未發生改變,因此確定藥物篩選最適質量濃度為20 mg/L。將構建的重組質粒YHM-SRV9-G與Piggy Bac轉座子酶輔助質粒共轉染BSR細胞,經blasticidin藥篩及單克隆純化后獲得穩轉細胞株。分別選取單克隆傳代1,8次,同時提取細胞基因組后進行PCR鑒定,結果顯示,細胞株在大約1 575 bp處出現目的條帶,對照組無條帶,證明RABV-G基因成功插入細胞基因組中(圖4)。選取F3代細胞株進行IFA鑒定,結果顯示,穩轉細胞株可在熒光顯微鏡下觀察到明亮且均一的綠色熒光,證明單克隆純化后獲得的細胞株可以高效表達RABV-G蛋白(圖5)。為進一步確定RABV-G在細胞中的表達位置,通過激光共聚焦顯微鏡進行鑒定(圖6),在穩轉細胞株的細胞膜上可觀察到均勻分布的紅色熒光,而且紅色熒光信號與商品化的細胞膜染料DIO有很好的共定位,證明RABV-G主要在細胞膜上表達。選取F8代細胞提取膜蛋白進行Western blot鑒定,結果顯示,細胞株可在約66 kDa處檢測到目的蛋白表達,與RABV-G蛋白大小相符,而BSR細胞對照沒有檢測到相應的特異性條帶(圖7),證明RABV-G正確表達且定位于細胞膜。綜上結果,表明成功構建了表達RABV-G的穩轉細胞株BSR-G。

M.DL2000 DNA Marker;1.陽性對照;2.F8代BSR-G細胞;3.F1代BSR-G細胞;4.陰性對照

A.BSR-G細胞;B.正常BSR細胞

圖6 穩轉細胞株RABV-G蛋白表達位置鑒定

M.蛋白Marker;1.BSR-G細胞;2.BSR細胞

2.4 穩轉細胞株的遺傳穩定性為了驗證穩轉細胞株BSR-G中 RABV-G蛋白表達的穩定性,選取F2、F8、F15代次細胞,利用IFA進行檢測,結果顯示,該細胞株從F2至F15代都能夠穩定表達RABV-G蛋白,證明該細胞株能夠穩定持續表達外源RABV-G蛋白(圖8)。

A.F2代BSR-G細胞;B.F8代BSR-G細胞;C.F15代BSR-G細胞

2.5 復制缺陷型重組狂犬病病毒在穩轉細胞株中的增殖將G基因缺失的重組病毒rSRV9-△G-eGFP按MOI=0.2分別單層接種BSR-G細胞和BSR細胞,通過觀察綠色熒光的表達評價重組病毒的增殖情況。結果顯示,rSRV9-△G-eGFP感染BSR-G細胞后可出現明顯增殖趨勢,而感染正常BSR細胞后則沒有增殖(圖9)。每24 h收集病毒感染BSR-G細胞上清培養物,進行病毒滴度測定,結果顯示,重組病毒rSRV9-△G-eGFP可在BSR-G細胞增殖,且病毒滴度可達105.3TCID50/mL;感染BSR細胞后,病毒滴度低于可檢測值(圖10)。由此表明,BSR-G細胞可用于復制缺陷型RABV的增殖培養。

圖9 重組病毒rSRV9-△G-eGFP的增殖情況

圖10 重組病毒rSRV9-△G-eGFP在BSR-G細胞和BSR細胞上的生長曲線

3 討論

疫苗免疫是控制傳染病暴發和流行的主要措施。傳統疫苗主要包括滅活疫苗和弱毒疫苗。滅活疫苗引起的細胞免疫較弱,持續時間短,以及各個抗原成分之間的免疫應答不平衡,往往需要多次免疫才能產生較好的免疫應答;弱毒疫苗存在毒力返強以及散毒的風險,限制了其在臨床的進一步應用[7]。針對新發、突發傳染病,積極采用新技術、新手段研發安全、高效的新型疫苗才能防患于未然[8]。復制缺陷型病毒疫苗不僅能誘導宿主產生體液免疫和細胞免疫,還具有良好的安全性。本研究構建了一種可用于復制缺陷型重組RABV增殖培養的穩轉細胞株,為狂犬病復制缺陷基因工程疫苗的研制奠定了基礎。

穩定表達外源蛋白的細胞系在基因和蛋白功能等生物學研究中具有重要作用。ITO等[9]構建了一種M基因缺陷的RABV RC-HL△M,該病毒僅在表達M蛋白的BHK-M細胞株上增殖,將RC-HL△M通過滴鼻免疫小鼠后誘導產生的中和抗體水平與RC-HL株相同。BLANEY等[10]和PAPANERI等[11]基于RABV反向遺傳操作系統,構建了表達Ebola GP的RABV G基因缺失的重組病毒BNSP-△G-GP,重組病毒BNSP-△G-GP可在表達RABV-G的BSR-RVG細胞系上復制增殖,在正常BSR細胞上則僅能進行單輪復制。動物試驗結果表明重組病毒BNSP-△G-GP可作為RABV和Ebola二聯疫苗候選株。KATO等[12]開發的表達MERS-S1的RABV-△P RABV疫苗,同樣借助表達RABV P蛋白的BHK-P細胞系進行疫苗候選株的增殖培養。本研究中,G基因缺失的重組病毒rSRV9-△G-eGFP感染BSR-G細胞后可成功增殖,但在BSR細胞中僅能進行單輪復制,表明rSRV9-△G-eGFP具有良好的安全性,可作為復制缺陷疫苗候選株。

構建穩轉細胞株(stable-transfection cell line)的基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上,重組載體被轉染到宿主細胞后定點或隨機整合到宿主細胞基因組中,之后根據載體所含有的抗性標志選用相應的藥物進行篩選,篩選得到可以穩定表達目的蛋白或者穩定表達特定基因的細胞株。建立穩定表達外源基因的細胞系有多種方法,常見的有質粒轉染、慢病毒感染等方式。利用慢病毒載體構建穩轉細胞系的方法除了需要構建所需的質粒,還需包裝并獲得高滴度的病毒,操作過程復雜繁瑣,且在操作過程中還要注意生物安全問題,而且慢病毒啟動外源基因表達的時間較長[13]。pcDNA3.1載體是構建真核細胞系傳統的載體之一,但是此載體缺少細胞基因組整合元件,所以用其構建細胞系的效率較低,而且在穩轉細胞的后期傳代過程中,常出現外源基因丟失的情況[14]。相比之前2種方法,轉座系統具有高容納量、高效率以及高安全性等優勢,而且轉座系統中的輔助質粒表達的轉座酶使外源基因可穩定插入細胞基因組上,在很大程度上降低外源基因丟失的可能性[15]。本試驗選用了在哺乳動物細胞中轉座活性更高的Piggy Bac轉座子系統[16]。Piggy Bac轉座子是可以在原核和真核生物基因組上進行基因位置改變的DNA片段,通過“剪切-粘貼”的機制在轉座子和染色體之間進行基因換位。Piggy Bac轉座酶識別轉座子載體兩端的反向重復序列(inverted terminal repeat sequences,ITRS)并將其插入宿主基因組的TTAA位點[17-18]。比較于傳統的轉座子系統,其有更高的整合效率,更高的目的基因表達效率。此外,也能容納更大目的片段的插入。與Sleeping Beauty轉座子系統相比,Piggy Bac轉座子具有更高的轉座活性[15-16]。此外,Sleeping Beauty轉座后會留下 3 bp的基因轉移足跡CAC,而Piggy Bac轉座后不會留下基因序列改變痕跡[19-22]。丁晟等[23]將Piggy Bac轉座子成功應用于小鼠和哺乳動物細胞基因功能的研究,實現了Piggy Bac轉座子在人和小鼠細胞中高效導入外源基因并穩定表達,并成功培育出了帶熒光的轉基因小鼠。LYNCH等[24]利用Piggy Bac轉座系統構建了能持續表達人類免疫缺陷型病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus type 1,HIV1)Gag蛋白的轉基因昆蟲細胞系,用于HIV-1 Gag病毒樣顆粒的制備。本研究構建的穩定表達RABV-G蛋白的細胞株BSR-G,連續進行15次傳代后仍可穩定表達RABV-G蛋白,表明BSR-G細胞具有良好的遺傳穩定性。

本研究利用Piggy Bac轉座子真核表達載體構建了表達RABV-G基因的重組表達質粒,并通過與輔助質粒Piggy Bac轉座酶的共轉染將RABV-G基因插入到細胞基因組,通過篩選單克隆的方法獲得穩定表達RABV-G蛋白的細胞株。將構建的穩轉細胞株應用于復制缺陷型重組RABV的增殖培養,使復制缺陷型重組RABV利用細胞表達的糖蛋白完成病毒生命周期,組裝出具有單次感染性的復制缺陷型病毒顆粒,并在穩轉細胞株上實現高效增殖。綜上所述,本研究構建的穩定表達RABV-G蛋白的BSR-G細胞株,可用于復制缺陷型重組RABV的拯救和增殖,為狂犬病新型疫苗和基于RABV載體的復制缺陷型基因工程疫苗的研制奠定了基礎。