中國(guó)荷斯坦奶牛LBP基因多態(tài)性分析及其與乳品質(zhì)性狀相關(guān)性

李嘉靈,陳佳怡,于海濱,姜 平,趙志輝

(廣東海洋大學(xué) 濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院,廣東 湛江 524088)

中國(guó)荷斯坦奶牛是我國(guó)重要的奶牛品種,經(jīng)過(guò)十多年的選種選育,現(xiàn)已是我國(guó)重要的高產(chǎn)乳用品種之一。張勝利等[1]指出,至2020年,我國(guó)奶牛單產(chǎn)水平已達(dá)8 300 kg,接近歐洲一些發(fā)達(dá)國(guó)家,在奶牛育種工作加持下,奶業(yè)迅速發(fā)展。但是在奶牛單產(chǎn)提升的同時(shí),目前我國(guó)對(duì)牛奶質(zhì)量的研究并不深入。馬廣旭等[2]于2020年以6省的城鄉(xiāng)居民為調(diào)研對(duì)象進(jìn)行居民的牛奶消費(fèi)狀況調(diào)查,提出我國(guó)應(yīng)研發(fā)低乳脂和高乳脂的乳制品,針對(duì)性開(kāi)發(fā)適合特殊人群飲用的乳產(chǎn)品,以提高居民牛奶消費(fèi)量。因此,對(duì)奶牛的相關(guān)經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行深入研究具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

LBP是脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白家族成員之一,由中心結(jié)構(gòu)域連接的N端和C端結(jié)構(gòu)域組成[3]。1986年TOBIAS從急性期兔血清中純化得到LBP。LBP的合成場(chǎng)所主要在肝細(xì)胞,并與細(xì)胞表面受體結(jié)合,啟動(dòng)先天宿主反應(yīng)。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)通過(guò)作用于動(dòng)物細(xì)胞而發(fā)揮其毒性,LBP與LPS結(jié)合形成高親和力復(fù)合物控制LPS的反應(yīng)[4]。白細(xì)胞分化抗原14(cluster of differentiation 14,CD14)可與LPS/LBP復(fù)合物結(jié)合,介導(dǎo)LPS對(duì)細(xì)胞的刺激作用[5]。LPS-LBP-CD14進(jìn)一步激活Toll樣受體4(Toll-like receptors 4,TLR4),釋放促炎因子和趨化因子,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[6]。SONG等[7]通過(guò)建立小鼠膿毒癥模型驗(yàn)證得出LBP通過(guò)LBP-PPARα-CYP4a2信號(hào)通路使得肝線粒體免受LPS誘導(dǎo)的損傷。已有多種研究表明,LBP是內(nèi)毒素血癥的標(biāo)志物[8-10]。

對(duì)LBP早期的研究多集中于免疫、炎癥反應(yīng)方面,隨著對(duì)LBP的深入研究,發(fā)現(xiàn)LBP還影響著機(jī)體許多代謝活動(dòng)。LBP是BPI家族的重要成員,參與脂代謝,從而參與心血管疾病的發(fā)生機(jī)制[11]。MORENO-NAVARRETE等[12]通過(guò)脂質(zhì)組學(xué)分析敲除LBP后脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)組學(xué)特征,發(fā)現(xiàn)敲除LBP后脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)體發(fā)生急劇變化。LATORRE等[13]通過(guò)手術(shù)干預(yù)注射shRNA-LBP慢病毒顆粒,構(gòu)建特定脂肪組織LBP基因敲低的模型小鼠,發(fā)現(xiàn)基因敲低后,小鼠血漿游離脂肪酸、瘦素、甘油三酯降低,脂肪增加相關(guān)基因表達(dá)量減少。MOLINARO等[14]發(fā)現(xiàn)下調(diào)LBP可以調(diào)節(jié)非肥胖小鼠的全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)。SUN等[15]通過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)肥胖受試者的體內(nèi)LBP水平顯著高于體質(zhì)量正常受試者,LBP水平的升高與2型糖尿病、代謝綜合征及肥胖有關(guān)。

目前的研究表明LBP多態(tài)性與炎癥反應(yīng)息息相關(guān)。ZENG等[16]研究發(fā)現(xiàn)rs2232618多態(tài)性與敗血癥和多器官功能障礙的更易感呈顯著相關(guān)。CASTANO-RODRIGUEZ等[17]研究發(fā)現(xiàn)LBP多態(tài)性與幽門(mén)螺旋桿菌感染的胃癌有明顯關(guān)聯(lián)。程結(jié)南[18]發(fā)現(xiàn)LBP多態(tài)性與荷斯坦奶牛臨床型乳腺炎發(fā)病率呈顯著相關(guān)。然而與奶牛奶品質(zhì)性狀的多態(tài)性研究鮮有報(bào)道。因此本研究以荷斯坦奶牛為群體,采用直接測(cè)序法研究LBP單核苷酸多態(tài)性,并分析SNPs位點(diǎn)與奶牛乳品質(zhì)性狀之間的相關(guān)性,為后期驗(yàn)證基因功能奠定基礎(chǔ),同時(shí)提供優(yōu)質(zhì)奶牛選種選育分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 樣品采集飼養(yǎng)環(huán)境相同的133頭中國(guó)荷斯坦奶牛來(lái)自黑龍江某牛場(chǎng),牛頸靜脈采血(5 mL/頭)于抗凝管中,置于-80℃保存。

1.2 主要試劑血液DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化有限公司;2×Taq Master Mix(Dye Plus)、50×TAE電泳緩沖液購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;瓊脂糖購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;DL2000 DNA Marker購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.3 基因組DNA提取根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取荷斯坦奶牛血樣DNA,使用Thermo ScientificTMNanoDrop Lite分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度,用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA提取效果,-20℃保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)根據(jù)Ensembl中公布的牛LBP基因序列(ENSBTAT00000022428.3),利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,引物序列見(jiàn)表1。設(shè)計(jì)好的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 LBP基因擴(kuò)增目的片段引物序列及相關(guān)信息

1.5 PCR擴(kuò)增目的條帶PCR反應(yīng)體系:2×Taq Master Mix(Dye Plus)10 μL,上、下游引物各0.5 μL,基因組DNA 1 μL,ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物置于4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果,若條帶單一、片段大小正確,送生工生物工程(上海) 股份有限公司測(cè)序。

1.6 性狀測(cè)定根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中《中國(guó)荷斯坦牛生產(chǎn)性能測(cè)定技術(shù)規(guī)范》采集樣品,牛乳中脂肪、蛋白、乳糖、體細(xì)胞、干物質(zhì)的測(cè)定采用乳成分分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增LBP基因目的片段以基因組DNA為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增LBP目的片段,產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖1,2,可見(jiàn)PCR產(chǎn)物條帶單一清晰、特異性好。參考DL2000 DNA Marker標(biāo)識(shí),所示條帶長(zhǎng)度與目的條帶相符。

M.DL2000 DNA Marker;1～7.分別為不同個(gè)體PCR擴(kuò)增目的片段

M.DL2000 DNA Marker;1～2.分別為不同個(gè)體PCR擴(kuò)增目的片段

2.2 LBP目的片段測(cè)序結(jié)果測(cè)序中共發(fā)現(xiàn)3個(gè)明顯套峰,分別位于第二內(nèi)含子5′端第1 095個(gè)堿基,由G突變?yōu)锳;第五內(nèi)含子5′端第142和199位堿基,第142位堿基由T突變?yōu)镃,第199位堿基由A突變?yōu)镚。這3個(gè)SNP為I2-1095 G>A、I5-142 T>C、I5-199 A>G(圖3); 3個(gè)SNPs不同基因型測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖4,5,6。

圖3 牛LBP基因混池DNA擴(kuò)增目的片段測(cè)序結(jié)果

圖4 牛LBP基因I2-1095 G>A位點(diǎn)3種基因型測(cè)序結(jié)果

圖5 牛LBP基因I5-142 T>C位點(diǎn)3種基因型測(cè)序結(jié)果

圖6 牛LBP基因I5-199 A>G位點(diǎn)3種基因型測(cè)序結(jié)果

2.3 LBP基因3個(gè)SNP位點(diǎn)的群體遺傳特性由表2可知,I2-1095 G>A位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因?yàn)镚,其頻率為0.654 1,該位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基因型為GG,頻率為0.443 6;I5-142 T>C位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因?yàn)門(mén),其頻率為0.556 4,該位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為T(mén)C,其頻率為0.496 2;I5-199 A>G位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因?yàn)镚,其頻率大于0.518 8,該位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為AG,其頻率為0.481 2。 3個(gè)SNPs的PIC和H均介于0.25與0.50之間,說(shuō)明該SNPs在群體中處于中度多態(tài)。χ2驗(yàn)證結(jié)果顯示, 3個(gè)SNPs位點(diǎn)在荷斯坦奶牛群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

表2 牛LBP基因SNPs群體遺傳特性

2.4 LBP基因SNPs位點(diǎn)不同基因型與中國(guó)荷斯坦奶牛乳品質(zhì)性狀的相關(guān)性分析在133個(gè)待測(cè)奶牛樣品中, 3個(gè)SNPs位點(diǎn)不同基因型的產(chǎn)奶量、乳脂、乳蛋白、乳糖、干物質(zhì)、體細(xì)胞、尿素氮、校正奶8個(gè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)平均值如表3。結(jié)果顯示,I2-1095 G>A位點(diǎn)與乳品質(zhì)性狀無(wú)顯著相關(guān)(P>0.05),I5-142 和I5-199的SNPs與奶牛乳品質(zhì)性狀中的乳糖、乳脂、體細(xì)胞、校正奶都呈顯著相關(guān)(P<0.05),此外,I5-142 T>C位點(diǎn)還與產(chǎn)奶量呈顯著相關(guān)(P<0.05)。I5-142 T>C、I5-199 A>G 2個(gè)SNPs與蛋白、干物質(zhì)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表3 牛LBP基因SNPs 3種基因型與中國(guó)荷斯坦奶牛生產(chǎn)性狀的相關(guān)性分析

I5-142 T>C位點(diǎn)TC基因型個(gè)體的產(chǎn)奶量顯著高于TT基因型(P<0.05);脂肪含量方面,TT型個(gè)體乳脂含量顯著高于TC型個(gè)體(P<0.05),極顯著高于CC型(P<0.01);TT型個(gè)體乳糖及校正奶含量極顯著小于TT、TC型個(gè)體(P<0.01);牛奶中體細(xì)胞的數(shù)量提示奶牛乳房感染情況,TT基因型個(gè)體的體細(xì)胞數(shù)量顯著高于TC、CC型個(gè)體(P<0.05)。

I5-199 A>G位點(diǎn)GG基因型個(gè)體的乳脂含量極顯著高于GA、AA型個(gè)體(P<0.01);GA基因型的乳糖含量最高,極顯著高于GG型個(gè)體(P<0.01);體細(xì)胞方面,GG型個(gè)體體細(xì)胞數(shù)最高,顯著高于GA型(P<0.05),極顯著高于AA型(P<0.01);GG型個(gè)體的校正奶含量極顯著小于GA、AA型。

2.5 LBP基因單倍型與中國(guó)荷斯坦奶牛乳品質(zhì)性狀的相關(guān)性分析對(duì)LBP 3個(gè)SNPs進(jìn)行單倍型分析,單倍型頻率見(jiàn)表4,共有5種單倍型組合,分別為H1H1、H1H2、H1H3、H2H3、H2H2。對(duì) 3個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析,發(fā)現(xiàn)I5-142 T>C、I5-199 A>G 2個(gè)SNPs存在強(qiáng)連鎖遺傳,見(jiàn)圖7。把5種單倍型與奶牛乳品質(zhì)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析(表5),結(jié)果顯示H1H2和H2H2單倍型個(gè)體產(chǎn)奶量顯著高于H1H3(P<0.05);H1H1型乳脂含量極顯著高于H1H2、H2H2型單倍型(P<0.01),顯著高于H1H3型個(gè)體(P<0.05);H1H2型個(gè)體含乳糖最高,極顯著高于H1H1型(P<0.01);H2H3型個(gè)體干物質(zhì)含量最高,極顯著高于其他單倍型(P<0.01);3種單倍型中,H1H1型個(gè)體含有數(shù)量最多的體細(xì)胞,顯著高于H1H2、H2H2單倍型(P<0.05);H1H2型個(gè)體的校正奶含量極顯著高于H1H1型(P<0.01),顯著高于H1H3型(P<0.05)。3種單倍型與蛋白含量無(wú)顯著相關(guān)(P>0.05)。

圖7 牛LBP基因SNPs位點(diǎn)連鎖分析

表4 牛LBP基因單倍型頻率

表5 牛LBP基因單倍型與中國(guó)荷斯坦奶牛生產(chǎn)性能相關(guān)性分析

3 討論

我國(guó)對(duì)高質(zhì)量奶的需求與日俱進(jìn),同時(shí)對(duì)進(jìn)口乳制品的依賴愈演愈烈。劉馨蔚[19]指出,我國(guó)奶業(yè)消費(fèi)水平持續(xù)增長(zhǎng),但增長(zhǎng)份額更多來(lái)自國(guó)外生鮮乳原料供應(yīng),截止2020年,我國(guó)奶源自給率僅為66%。這將使我國(guó)奶業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力置于不利地位,提高我國(guó)乳制品質(zhì)量及產(chǎn)量從而提升我國(guó)消費(fèi)者對(duì)乳制品的信心尤為重要。

LBP來(lái)源于肝臟,是一種急性期蛋白,主要參與調(diào)節(jié)革蘭陰性菌引起的免疫反應(yīng)。而革蘭陰性菌是奶牛臨床乳腺炎常見(jiàn)的病原體,感染后可降低牛奶質(zhì)量與產(chǎn)量,導(dǎo)致不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。本研究發(fā)現(xiàn)LBP 2個(gè)SNPs均與目標(biāo)奶牛群體的乳脂、乳糖、體細(xì)胞、校正奶含量呈顯著相關(guān)關(guān)系,其中I5-142 T>C位點(diǎn)還與產(chǎn)奶量顯著相關(guān)。目前關(guān)于牛LBP多態(tài)性的報(bào)道多以乳腺炎、乳房炎為主。CHENG[20]采用PCR-SSCP方法對(duì)奶牛LBP基因進(jìn)行SNP分析,發(fā)現(xiàn)g.4619G → A位點(diǎn)GA基因型個(gè)體臨床乳腺炎發(fā)病率顯著高于其他兩種基因型。SUN等[21]發(fā)現(xiàn)牛重組LPS結(jié)合蛋白(BRLBP)可消減LPS誘導(dǎo)的BMEC炎癥損傷。ZENG等[22]發(fā)現(xiàn)患有臨床乳腺炎奶牛的牛奶中體細(xì)胞數(shù)量是健康奶牛牛奶體細(xì)胞的9倍,且牛奶中LBP含量高于健康群體,血液中LBP含量顯著高于健康組。牛奶中的體細(xì)胞數(shù)提示著乳房或乳腺的炎癥反應(yīng)程度,固LBP可能與體細(xì)胞數(shù)有關(guān),這也印證了本研究中LBP多態(tài)性與體細(xì)胞呈顯著相關(guān)。

TSUGAMI等[23]和KOBAYASHI等[24]用LPS處理BMECs,發(fā)現(xiàn)LPS處理后會(huì)降低β-酪蛋白、乳糖和甘油三酯的分泌,并且LPS處理后細(xì)胞表達(dá)STAT3和NF-κB顯著增加,STAT3和NF-κB信號(hào)通路的激活會(huì)抑制乳腺產(chǎn)奶量,從而說(shuō)明LPS對(duì)產(chǎn)奶量有影響。LBP通過(guò)與LPS形成高親和力復(fù)合體參與機(jī)體的調(diào)節(jié)活動(dòng),與LBP結(jié)合是LPS轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)的基本步驟[3]。LBP與LPS的結(jié)合能力也從側(cè)面提供了LBP與產(chǎn)奶量、乳脂、乳糖的相關(guān)性信息。WANG等[26]發(fā)現(xiàn)TLR4 c.-226 G >C和 c.2021 C >T這2個(gè)SNPs位點(diǎn)與奶牛產(chǎn)奶量有顯著關(guān)系。CHRISTINE等[27]發(fā)現(xiàn) CD14-1908 A 等位基因與乳脂和蛋白質(zhì)產(chǎn)量存在相關(guān)關(guān)系。根據(jù)TLR4、CD14是LBP下游基因的關(guān)系,推斷LBP多態(tài)性與產(chǎn)奶量、乳脂也存在聯(lián)系。目前尚無(wú)研究報(bào)道牛LBP基因是否影響乳糖調(diào)節(jié),LBP參與糖代謝的研究集中在葡萄糖方面。MOLINARO等[14]使用CRISPR/CAS9技術(shù)敲低了肝臟中LBP,發(fā)現(xiàn)LBP可調(diào)節(jié)機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)。本研究首次研究牛LBP多態(tài)性對(duì)奶牛生產(chǎn)性狀的影響,并發(fā)現(xiàn)LBP 2個(gè)SNPs與產(chǎn)奶量、乳脂、乳糖、體細(xì)胞、校正奶有顯著影響。

對(duì)LBP基因 2個(gè)SNPs進(jìn)行連鎖不平衡分析,結(jié)果顯示SNPs強(qiáng)連鎖遺傳,共有3種單倍型,且與奶牛生產(chǎn)性狀顯著相關(guān)。把SNPs 3種單倍型與生產(chǎn)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果提示體細(xì)胞數(shù)與脂肪、乳糖、校正奶呈負(fù)相關(guān),與干物質(zhì)呈正相關(guān)。H1H1型個(gè)體體細(xì)胞數(shù)超過(guò)《中國(guó)奶業(yè)D20標(biāo)準(zhǔn)生牛乳》中的體細(xì)胞數(shù)量,提示H1H1型個(gè)體患有乳房疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加。H1H2、H2H2型個(gè)體在乳脂、乳糖、干物質(zhì)、校正奶方面并沒(méi)有顯著性差異,結(jié)合各項(xiàng)指標(biāo)的平均值,提示H1H2單倍型可能為最優(yōu)選擇。該單倍型可作為奶牛選種選育的分子標(biāo)記,可提高奶牛生產(chǎn)性能。

本研究發(fā)現(xiàn)牛LBP基因I2-1095 G>A、I5-142 T>C、I5-199 A>G 3個(gè)SNPs對(duì)中國(guó)荷斯坦奶牛部分經(jīng)濟(jì)性狀產(chǎn)生顯著影響,分別有產(chǎn)奶量、乳糖、乳脂、校正奶和體細(xì)胞數(shù)。這些SNPs為將來(lái)奶牛的生產(chǎn)性狀輔助選擇提供有價(jià)值的分子標(biāo)記,并豐富了奶牛選種選育的基因資源,亦為日后對(duì)LBP進(jìn)行深入的功能研究奠定了基礎(chǔ)。