鐵莧菜對RAW 264.7細胞NLRP3及炎癥因子表達的影響

尕 玉,樊藝萌,王惠茹,魏媛媛,張艷楠,郝智慧

(中國農業大學 動物醫學院,北京 100193)

潰瘍性結腸炎 (ulcerative colitis,UC) 是一種以腹瀉、膿血便、腹痛、發熱和體質量減輕為臨床癥狀的慢性非特異性腸道炎癥性疾病,主要發生于結腸的黏膜層和黏膜下層[1]。腸道免疫系統失調及腸屏障功能改變可能是導致UC發生的主要原因[2],但其發病機制尚未明確。目前針對UC還沒有特異性的治療措施,臨床用藥,包括皮質類固醇、氨基水楊酸鹽和抗生素[3-4],以緩解癥狀為主要原則,這些藥物不僅成本較高,且患者使用后常出現不良反應,不能根治及杜絕潰UC的復發。中藥(Chinese traditional medicine,CTM)具有成分多樣、療效穩定、作用溫和持久及毒性和不良反應小等優點,使得CTM在治療一些頑疾方面往往具有西藥不可替代的優勢。網絡藥理學是一種基于藥物、疾病的相關靶點基因以及蛋白質相互作用網絡的系統分析方法。能夠從整體角度揭示藥物的作用機理、協同作用和動態特征,這些特征與中醫治療整體理論的特征相一致,為中藥藥理的發展提供理論指導。

鐵覓菜(AcalyphaaustralisL.,AAL)為大戟科鐵覓菜屬鐵覓菜的干燥全草,性涼、味苦澀,具有抗炎鎮痛活性[5]。《內經》云:“苦能燥濕”“澀能固瀉”,故民間常用于止血、止痢、止瀉。現代藥理學研究表明其具有抗腹瀉、抗UC、抗菌、抗病毒、止血、止咳祛痰、平喘等多種作用[6-7]。AAL常用于腹瀉的治療,但其抗UC的藥理、藥效及機制的研究極少。已有研究表明,AAL水提物可以減輕TNBs誘導的大鼠UC模型中腹瀉與便血率,降低炎性細胞浸潤和MPO酶、SOD的水平[8-9],且通過抑制iNOS基因的表達減少NO過量生成[10-11]。

因此,本研究采用中藥網絡藥理學結合脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導RAW 264.7細胞炎癥模型的方法共同探討AAL治療UC的作用機制。以LPS刺激RAW 264.7巨噬細胞增殖,構建體外炎癥模型,研究AAL對炎癥小體NLRP3和炎癥因子的影響。通過檢測炎癥因子、NLRP3相關蛋白和mRNA表達水平,探討AAL治療UC可能參與的信號通路與分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑AAL,2021年8月采自浙江麗水,經中國醫學科學院藥用植物研究所鑒定為大戟科鐵莧菜屬植物鐵莧菜(AcalyphaaustralisL.);鹽酸小檗堿 (國藥準字:H61021392),陜西頤生堂藥業有限公司,規格0.1 g/片;DMEM高糖培養基 (A1370801)、胎牛血清 (16140071),LPS (L8880,純度>98%)、Calcein-AM/PI試劑盒 (CA1630)、總蛋白提取試劑盒(強) (BC3710)、BCA蛋白濃度測定試劑盒 (PC0020 )均購自北京索萊寶科技有限公司;GoScriptTM反轉錄試劑盒 (A6001,00987373) 購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司;預染蛋白Marker (26617)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;ECL 顯影液 (GNWB-006,202307)購自北京京北日晟生物有限公司;TaKaRa Custom Oligo DNA/RNA (5015)購自TaKaRa Bio Inc (Japan)有限公司。

1.2 主要儀器倒置熒光顯微鏡 (Olympus公司,型號:DP74);CO2培養箱 (上海億恒科學儀器有限公司,型號:BPN-80CRH(UV));PCR儀 (Bio Red公司,型號:T100TM);實時熒光定量PCR系統 (BIO-RAD公司,型號:CFX96TM);垂直電泳轉印系統 (BIO-RAD公司,型號:PowerPacTMBasic);凝膠成像儀 (Cytiva公司,型號:Image Quant 800);多功能酶標儀 (Tecan公司,型號:INFINITE M NANO)。

1.3 AAL及UC相關靶點的獲取通過閱讀文獻獲得AAL中含有的化學成分,根據化源網 (https://www.chemsrc.com/) 進行CAS號的轉換。將轉換所得的唯一CAS號輸入PubChem數據庫 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),收集相應的2D結構圖及SMILES號。再通過結構圖及SMILE號進行ADME (http://www.swissadme.ch/) 篩選,獲得活性化合物,篩選條件為腸胃吸收(gatrointestinal absortion;GIabsortion)為 “High”,且5種類藥性預測 (Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge) 結果中有2個及以上為 “Yes”。在 SWISS Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) 平臺對活性化合物進行靶點預測,最終獲得鐵莧菜的相關靶點。

使用人類基因數據庫 (GeneCards,https://www.genecards.org/) ,OMIM數據庫(https://omim.org/),藥物靶點數據庫(DRUGBANK,https://go.drugbank.com/) 和治療靶點數據庫(TTD,http://db.idrblab.net/ttd/)以 “ulcerative colitis” 為關鍵詞獲得UC相關的靶點。

利用VENNY 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對以上獲得的中藥靶點與疾病靶點取交集,獲得的靶點被認為是AAL在治療UC中的潛在靶點,并繪制韋恩圖(Venn)圖,然后利用Cytoscape 3.8(http://www.cytoscape.org/)軟件分析獲得Degree值,繪制“鐵莧菜-成分”網絡圖。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)將交集靶點輸入STRING數據庫 (https://string-db.org/),來識別可能的蛋白質間相互作用。為了提高所獲得數據庫的可靠性,對蛋白質-蛋白質相互作用進行了進一步過濾,最小交互作用得分為0.40,篩選后的蛋白質-蛋白質相互作用用于網絡構建和分析。使用Cytoscape構建PPI網絡,使用網絡分析儀計算 “度” (degree) 等參數。

1.5 GO功能富集分析和KEGG途徑富集分析根據Cytoscape構建的PPI網絡,按Degree大小排序,取前20個靶點作為核心靶點,進行KEGG和GO分析。將核心靶點導入基因注釋和分析數據庫(David,https://david.ncifcrf.gov/) 中,將Analysis as species設置為H.sapiens,保存AAL治療UC的GO分析和KEGG通路分析結果。通過篩選獲得GO分析和KEGG通路分析中排名前20的結果,并繪制富集氣泡圖以及柱狀分析圖。

1.6 細胞培養、LPS配制及AAL處理RAW 264.7巨噬細胞用含10% FBS、1%雙抗的DMEM高糖培養液于37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養,并取對數生長期時的細胞用于實驗。LPS用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)配成可穩定保存的質量濃度為1 g/L的均勻溶液,并用不含有10% FBS的完全培養液稀釋到1 mg/L用于后續試驗。選用LPS刺激RAW 264.7巨噬細胞建立的焦亡炎性增殖模型作為本次的試驗模型。

選取新鮮的鐵莧菜,除去根莖,洗凈晾干,在超凈工作臺內紫外線照射20 min。取一干凈、滅菌的研缽,放入少許滅菌處理過的石英砂,將紫外線處理后的AAL放入研缽中充分研磨,用4層紗布擠壓過濾得到AAL濾液(表1),得到的濾液濃度定義為1 g/mL,經0.22 μm水膜過濾后,保存于-20℃,取不含有10%FBS的細胞培養液進行后續稀釋。

表1 AAL得汁率

1.7 細胞分組與處理將RAW 264.7細胞分為空白對照組(C)、LPS組(LPS)、陽性藥物組(B)、AAL高劑量組(AAL-H)、AAL中劑量組(AAL-M)、AAL低劑量組(AAL-L)。待細胞長至80%～90%匯合狀態時,各組進行如下處理:對照組,加入維持培養基(10% FBS)作用于細胞24 h;LPS組,加入1 mg/L 的LPS作用于細胞24 h;陽性藥物組,同時加入1/2 體積1 mg/L 的LPS和1/2 體積20 mg/L 小檗堿(BBR)作用于細胞24 h;鐵莧菜給藥組,同時加入1/2 體積1 mg/L 的LPS和1/2 體積不同質量濃度的AAL作用于細胞24 h。

1.8 CCK8法檢測細胞活力將細胞按照每孔1×104/個接種于96孔培養板中,每孔100 μL,并分為空白對照組和不同濃度LPS組,每個組設置6個重復孔。各組細胞培養24 h后,棄去上清,除空白對照孔外,其余每孔加入100 μL不同質量濃度LPS溶液(10.0,5.0,1.0,0.5,0.1 mg/L),繼續培養24 h。每孔加入100 μL CCK8溶液(10%),避光孵育2.5 h 后,酶標儀上于波長450 nm處測定各孔吸光度(D450)值。

將細胞按照每孔1×104/個接種于96孔培養板中,并分為對照組和不同濃度AAL+LPS組(LPS濃度根據CCK8實驗結果選擇),每組設置6個復孔。藥物處理組分別同時加入50 μL不同質量濃度AAL(900,800,700,500,400,200,100,50,10,1 mg/L)及50 μL 1 mg/L的LPS培養24 h。每孔加入100 μL CCK8溶液(10%),避光孵育2.5 h后,酶標儀上于波長450 nm處測定各孔吸光度(D450)值。重復以上試驗3次。

1.9 Calcein-AM/PI活/死細胞染色法檢測細胞活力將RAW 264.7細胞按照每孔1×105/個接種于24孔板中,每孔500 μL。用1× Assay Buffer充分清洗細胞2～3次,之后每孔加入500 μL染色工作液。工作液配法:取5 μL鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)溶液和15 μL碘化丙啶(PI)溶液加入5 mL 1× Assay Buffer,37℃孵育15 min,熒光顯微鏡下使用(490±10)nm 激發濾片同時檢測活細胞(黃綠色熒光)以及死細胞(紅色熒光)。

1.10 RT-qPCR檢測細胞中NLRP3、GSDMD、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18、MUC-2和OCLN的mRNA的表達將RAW 264.7細胞按照每孔1×106/個接種于6孔板中,每孔2 mL,細胞分組及處理同1.7;用PBS清洗3次,每孔加入500 μL TRIzol,室溫裂解5 min,收集細胞裂解液于1.5 mL無酶離心管中;向離心管中加入200 μL氯仿,振蕩30 s,室溫靜置3 min;12 000 r/min離心10 min,取上清;加入等體積異丙醇,混勻,室溫靜置10 min;12 000 r/min離心10 min,棄上清;加入1 mL預冷75%乙醇;10 000 r/min離心5 min,棄上清;將離心管倒扣5 min,加入20～50 μL無菌水,獲得RNA。按照逆轉錄試劑盒說明書,以RNA為模板進行反轉錄,得到cDNA。用表2中引物進行擴增。擴增程序:95℃預變性120 s;95℃變性5 s,64℃退火30 s;40個循環。以GAPDH為內參照基因,采用2-ΔΔCt法計算NLRP3、GSDMD、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18、MUC-2和OCLN mRNA的相對表達量。重復以上試驗3次。

表2 RT-qPCR引物與探針序列相關信息

1.11 Western blot檢測細胞中NLRP3、GSDMD、Caspase-1和ASC蛋白的表達將RAW 264.7細胞按照每孔1×106/個接種于6孔板中,每孔2 mL。收集細胞提取蛋白并用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白質量濃度。通過SDS-PAGE分離蛋白,將蛋白轉移至PVDF膜上,用5%的脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉2 h,分別孵育NLRP3、GSDMD、Caspase-1、ASC和β-actin(1∶1 000)抗體,4℃過夜。用TBST緩沖液洗膜3次,每次15 min,在室溫下孵育相對應的二抗2 h,用TBST緩沖液洗膜3次,每次15 min,用ECL化學發光法曝光。使用Image J軟件分析條帶灰度值。重復以上試驗3次。

2 結 果

2.1 AAL中藥活性成分和靶點篩選文獻報道的AAL成分共66個,經ADME篩選保留其中29個活性成分,對以上成分進行靶點預測時發現,共有6個成分 ((-)-Epicatechin,(-)-Gallocatechin,Cianidanol,(+)-Gallocatechin,(-)-Epicatechin,(+)-Epicatechin)無法預測靶點,其余23個成分共預測出359個靶點。構建“AAL-有效成分”網絡圖(圖1A),將有效成分按Degree值排序,前4分別為槲皮素,5,7,4c-三羥(基)黃酮、黃芩素和柚皮素。

圖1 AAL治療UC的潛在靶點分析

通過疾病數據庫一共獲得4 766個UC相關靶點,取交集后獲得210個交集靶點(圖1B)。由PPI網絡圖(圖1C)可知AAL最有可能通過交集靶點中的AKT1,VEGFA,EGFR,SRC,CASP3,MAPK3等發揮抗UC的作用。

2.2 AAL治療UC的靶點GO及KEGG分析將AAL治療UC的核心靶點導入David數據庫進行功能分析與通路富集分析,進行GO功能分析,共獲得生物過程(biological process,BP)247個,主要涉及:RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控,凋亡過程的負調控,基因表達的正向調節,細胞增殖的正向調節,DNA模板轉錄的正調節,信號傳輸;細胞組份(cellular component,CC)27個,主要涉及:細胞質,細胞核,核漿,質膜;分子功能(molecular function,MF)45個,主要涉及:蛋白結合,相同蛋白結合,酶結合。將各功能排名前10的BP、CC及MF繪制成柱狀圖(圖2A)。根據富集程度和顯著性,篩選出了排名前20的KEGG信號通路(圖2B),主要涉及癌癥中的通路,癌癥中的蛋白聚糖,癌癥中的微小核糖核酸,脂質和動脈粥樣硬化,人巨細胞病毒感染,PI3K-Akt信號通路等與治療UC有關的通路。并通過Cytoscape構建“中藥-靶點-信號通路-疾病”網絡圖(圖2C)。

圖2 AAL治療UC的GO、KEGG分析及“中藥-靶點-信號通路-疾病”網絡圖

2.3 AAL抑制LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞活力的增加與空白對照組相比,RAW 264.7細胞受到LPS (10,5,1 mg/L) 刺激后,細胞活力均顯著升高 (P<0.01),證明炎癥模型造模成功。后續試驗中選擇最低有效質量濃度1 mg/L作為造模劑量。

如圖3所示,與對照組相比,AAL給藥組呈現低濃度促進RAW 264.7細胞增殖,高濃度抑制RAW 264.7細胞增殖的效果,其中給予900,800,700 mg/L AAL處理后,RAW 264.7細胞活力下降(P<0.01),表明巨噬細胞增殖受到顯著抑制。后續試驗中選用有效抑制濃度900,800,700 mg/L分別作為AAL高、中、低劑量組給藥濃度。

圖3 不同濃度AAL與LPS處理后的RAW 264.7細胞活力

2.4 AAL降低LPS誘導的細胞的凋亡采用Calcein-AM/PI活/死細胞染色法測定活細胞比率,其中紅色熒光代表凋亡細胞,綠色熒光代表活細胞。結果如圖4所示,與空白對照組相比,LPS組紅色熒光增多,活細胞比率顯著降低,證明LPS可誘導細胞大量凋亡。與LPS組相比,小檗堿組和AAL低、中、高劑量組的紅色熒光明顯減少,綠色熒光增多,表明鹽酸小檗堿與AAL均可以恢復由LPS造成的細胞凋亡(P<0.01),并且AAL對凋亡的抑制作用呈劑量依賴性增強。

A.對照組;B.LPS處理組;C.BBR組; D～F.分別為AAL低、中、高劑量組。柱狀圖是對圖A～F中活細胞比率的定量分析結果。**P<0.01,與空白對照組差異極顯著;##P<0.01,與LPS組差異極顯著。下同

2.5 AAL對LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞IL-1β和IL-18的mRNA 表達的影響與對照組相比,LPS造模組IL-1β和IL-18-RNA所表達水平均顯著升高 (P<0.01);與LPS組相比,AAL低、中、高劑量的IL-1β和IL-18 mRNA水平顯著下降 (P<0.01)(圖5)。

圖5 AAL對LPS誘導RAW 264.7巨噬細胞IL-1β(A)和IL-18(B) mRNA 表達的影響

2.6 AAL對LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞NLRP3,GSDMD,Casp1和ASC的mRNA表達的影響RAW 264.7細胞中炎癥小體NLRP3相關基因 (NLRP3,GSDMD,Casp1和ASC)的表達結果見圖6。與對照組相比,模型組中RAW 264.7巨噬細胞NLRP3、GSDMD、Casp1和ASC的mRNA表達顯著升高 (P<0.01);鹽酸小檗堿及高、中、低劑量AAL處理后以上基因表達量與模型組相比均顯著降低 (P<0.01)。

A～D.NLRP3、GSDMD、Caspase-1和ASC的mRNA 表達水平

2.7 AAL對LPS誘導RAW 264.7巨噬細胞NLRP3,GSDMD,Caspase-1,Pro-caspase-1和ASC蛋白表達的影響基于以上試驗結果,對aal對LPS誘導RAW 264.7巨噬細胞NLRP3、GSDMD、Caspase-1、Pro-caspase-1和ASC蛋白表達的影響進行了研究。與對照組比較,LPS組NLRP3、GSDMD、Caspase-1、Pro-caspase-1和ASC的蛋白表達水平均顯著升高 (P<0.01);小檗堿組和AAL低、中、高劑量組與LPS造模組比較,以上指標均顯著下調 (P<0.01)(圖7)。

A.NLRP3、GSDMD-N、Pro-caspase-1、Caspase-1和ASC的蛋白表達水平;B～F.分別為NLRP3、GSDMD、Caspase-1、Pro-caspase-1和ASC 蛋白表達量化結果

2.8 AAL對LPS誘導RAW 264.7巨噬細胞OCLN和MUC-2 mRNA 表達的影響從MUC-2和OCLN 2個蛋白的基因角度研究了AAL是否可以調節LPS誘導的腸屏障損傷。LPS組與對照組相比,OCLN和MUC-2的mRNA表達均顯著下降 (P<0.01);小檗堿組和低、中、高劑量AAL組與LPS造模組比較,以上指標均顯著升高 (P<0.01)(圖8)。

圖8 AAL對LPS誘導RAW 264.7巨噬細胞OCLN(A)和MUC-2(B)mRNA 表達的影響

3 討論

AAL廣泛分布于美洲、非洲和亞洲的熱帶和亞熱帶地區的路邊和農田[12],國內常將其用于止血、止痢、止瀉,且發現AAL對治療慢性結腸炎具有較好的效果[13-14]。據報道,AAL治療人慢性結腸炎的總有效率達到96.4%[4]。但其中的具體機制尚不明確。通過網絡藥理學分析發現AAL治療UC潛在活性成分主要為槲皮素、5,7,4c-三羥(基)黃酮、黃芩素、柚皮素等。有關研究發現槲皮素可通過上調SIRT1表達,抑制NLRP3促炎反應,提高M2型巨噬細胞介導的抗炎和促神經恢復作用,改善實驗性巨結腸大鼠結腸炎性損傷[15]。按照DPPH方法測試5,7,4c-三羥(基)黃酮的自由基清除活性(FRSA),結果顯示其抗氧化活性呈劑量依賴性[16]。黃芩素通過miR-192-5p/TXNIP軸抑制NLRP3/Caspase-1通路減輕高脂血癥性胰腺炎的細胞焦亡和炎癥[17]。柚皮素通過miR-22抑制NLRP3炎癥小體并減輕UC大鼠模型腸屏障損傷[18]。在PPI蛋白互作結果中可知,AKT1,VEGFA,EGFR,SRC,CASP3,MAPK3的節點較大,推測這些節點可能是治療UC的主要靶點。通過David數據庫進行GO以及KEGG富集分析,主要涉及凋亡過程的負調控及PI3K-Akt信號通路等過程。提示AAL治療UC的潛在作用機制多集中在影響細胞增殖、轉移以及凋亡等生物過程。

小檗堿是一種異喹啉類生物堿,從傳統中藥黃連中提取而來[19],早在1977年就有報道稱小檗堿能抑制霍亂毒素所致的炎癥反應[18],近年來研究表明小檗堿可以通過多種信號途徑發揮其抗炎作用并且效果顯著[20-21]。故在本研究中,利用LPS誘導體外炎癥模型,并使用小檗堿作為陽性對照藥物,初步確定了AAL抗炎作用的效果以及通過NLRP3炎癥小體發揮抗炎作用的機制。

巨噬細胞作為炎癥反應中的關鍵細胞,通過釋放多種促炎細胞因子和介質防止病原體入侵。LPS是常見的炎癥介導因子,通過誘導巨噬細胞中許多促炎介質的表達而充當炎癥的有效引發劑[13]。在LPS誘導的巨噬細胞炎癥模型中,細胞外LPS被Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)識別,導致大量促炎因子產生,誘導炎癥反應[22-23]。本研究發現,使用10.0,5.0,1.0,0.5 mg/L的LPS處理小鼠RAW 264.7細胞后,細胞活力均顯著升高 (P<0.05),這與研究報道結果一致[23-24],表明LPS誘導不同程度的炎癥反應,本試驗選用最低有效濃度1 mg/L作為后續試驗造模濃度。使用900,800,700 mg/L 的AAL濾液處理可以顯著降低經LPS處理后的細胞活力 (P<0.01),減輕LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞炎癥反應。同時本研究通過Calcein-AM/PI染色發現,與對照組相比,LPS處理后活細胞比率下降,AAL預處理后活細胞比率升高,表明LPS在刺激巨噬細胞增殖的同時會造成細胞損傷死亡,而AAL可以逆轉這一現象。這可能與LPS激活NLRP3炎癥小體有關。因此本研究通過檢測NLRP3炎癥小體相關mRNA及蛋白表達,進一步探究了AAL濾液減輕炎癥的分子機制。

炎癥小體包括NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2、NLRP6等亞型,其中NLRP3是研究最為全面的亞型之一,正迅速成為腸道內穩態和腸道炎癥反應的重要調節因子。巨噬細胞識別病原體相關分子模式 (pathogen-associated molecular patterns,PAMPs) 信號,并通過模式識別受體 (pattern recognition receptor,PRR) 啟動炎癥反應,TLR4通過識別LPS進一步激活NLRP3,NLRP3受到損傷相關分子模式 (damage associated molecular patterns,DAMPs) 信號刺激,與ASC和Pro-caspase-1組裝成活性NLRP3炎癥小體復合物,釋放成熟的Caspase-1,后者將GSDMD切割為C端和N端,GSDMD-N端片段與質膜結合誘導細胞焦亡,死亡細胞大量釋放IL-1β和IL-18,導致炎癥發生[25-27]。本研究發現,與空白對照組相比,LPS處理后小鼠RAW 264.7巨噬細胞中NLRP3、GSDMD-N、ASC、Pro-caspase-1、Caspase-1的mRNA水平和蛋白表達水平顯著上升,IL-1β和IL-18的mRNA水平顯著增加,與JIE等[27]研究結果一致,提示NLRP3/Caspase-1通路的異常激活參與LPS誘導的炎癥。用不同濃度的AAL預處理細胞,研究AAL對NLRP3炎癥小體和炎癥的影響,發現AAL可以降低Caspase-1焦亡途經中關鍵基因的mRNA和蛋白表達水平,提示AAL可能通過抑制NLRP3/Caspase-1信號通路抑制細胞焦亡,降低炎性細胞因子水平,發揮抗炎作用。

在各類炎癥反應中,腸道炎癥參與多種疾病進展。腸黏膜屏障對于維持腸道內穩態、抵御病原微生物入侵有關鍵作用。MUC-2由杯狀細胞分泌,是小腸黏液的主要成分之一,對腸上皮細胞有保護和潤滑作用。Occludin是一種緊密連接蛋白,對于維持腸道屏障的完整性和功能具有重要意義[28-29]。本研究發現,與對照組相比,LPS處理顯著下調了OCLN和MUC-2的mRNA表達水平,AAL處理后顯著提高了MUC-2和OCLN的mRNA表達水平,表明AAL可以減輕LPS誘導的腸黏膜屏障損傷,提示AAL可以通過維持腸黏膜屏障減輕炎癥反應。

綜上所述,通過LPS建立的體外炎癥模型中,AAL具有顯著抗炎作用,其作用機制可能與抑制NLRP3/Caspase-1信號通路的關鍵基因有關,從而降低炎癥因子的釋放。表明AAL可以為炎癥性疾病提供新的治療策略。