miRNA-148a-3p對山羊卵巢顆粒細胞功能的影響

王鈺錕,李碧筠,張義語,丁文飛,王 磊,唐 雪,宋帥飛,姚 慧,黃德利,徐德軍,趙中權*

(1.西南大學 動物科學技術學院,重慶 400715;2.重慶市大足區農業技術服務中心,重慶 402360)

卵巢的生長發育與顆粒細胞的增殖和凋亡有密切關系。顆粒細胞增殖和凋亡的紊亂會導致卵泡功能無法正常運作,從而降低哺乳動物繁殖性能[1]。自噬過程不僅維持細胞正常運作,同時也決定顆粒細胞的存活與死亡。顆粒細胞自噬過程可以調控細胞自身活力,參與卵泡生長發育,越來越多的證據表明顆粒細胞自噬與卵泡閉鎖有關[2]。CHOI等[3]發現自噬通過調節Bcl-2/Bax比值調控黃體細胞凋亡,Bcl-2下調通過調節自噬小體積累誘導顆粒細胞凋亡。還有研究發現,卵泡閉鎖期間自噬被激活,促進顆粒細胞凋亡[4]。雌二醇(E2)和孕激素(P4)等類固醇激素在牛、羊和豬卵泡生長發育中起不可忽視的作用。其中E2主要參與卵泡閉鎖和顆粒細胞凋亡[5],P4會減緩卵泡發育、抑制顆粒細胞的有絲分裂、抑制細胞凋亡,能維持顆粒細胞狀態、平衡卵泡數量以及提高卵巢儲備[6]。

miR-148a-3p是miR-148/152家族的成員,該家族包含miR-148a、miR-148b和miR-152,這一家族的成員含有21～22個核苷酸[7]。miR-148/152家族成員在許多組織不同的生長發育階段中差異表達,也在腫瘤的生長發育及發生過程中差異表達,其生理功能是多方面的,包括控制細胞增殖、分化及凋亡等[8]。相關報道表明miR-148/152家族成員可能會抑制癌基因表達,并且抑制癌細胞的增殖與遷移活動。同時,越來越多的研究發現,miR-148/152家族成員不僅在腫瘤疾病中發揮作用,在例如IgA腎病[9]、動脈粥樣硬化病變[10]等的疾病中也起重要作用。

XU等[11]研究發現,miR-148a-3p通過靶向ROCK-1抑制膀胱癌細胞的增殖和遷移。BAO等[12]發現,miR-148a-3p可抑制癌癥發展進程,是一種新型的胃癌診斷生物標志物,其在胃癌患者的組織和血漿樣本中的表達量均明顯下調,在胃癌細胞中過表達miR-148a-3p可以抑制細胞的增殖和轉移。鄧艷等[13]發現,miR-148a-3p在鵝卵巢顆粒細胞中可特異性靶向結合PPARγ,進而抑制孕酮合成的關鍵基因3β-HSD表達從而降低顆粒細胞類固醇激素的分泌。以上研究證明miR-148a-3p在調控細胞生命活力中發揮重要作用,但其在山羊卵巢顆粒細胞中的具體功能尚不清楚,因此本研究通過過表達或抑制miRNA-148a-3p,探究其對卵巢顆粒細胞增殖、凋亡、自噬及類固醇激素分泌的影響,為深入揭示miRNA調節卵泡發育與閉鎖的機理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DMEM/F-12、FBS、胰酶購自美國Hyclone公司;miR-148a-3p mimics、miR-148a-3p inhibitor購自生工生物工程(上海)股份有限公司;EndoFectinTMMax轉染試劑購自萊博斯生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自索萊寶科技有限公司;AdPlus-mcherry-GFP-LC3B、BeyoClickTMEdU-594細胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司;CCK-8 試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自葆光生物技術有限公司;RNAiso、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅢ、MiR-XTMmiRNA FirstStrand Synthesis購自TaKaRa公司;GAPDH Rabbit pAb、Bax Rabbit pAb、Bcl-2 Rabbit pAb、Anti-Rabbit IgG(H+L)購自Proteintech公司;PCNA Rabbit pAb、STAR Rabbit pAb、CYP11A1 Rabbit pAb、CYP19A1 Rabbit pAb購自Bioworld Technology公司;HSD3B1 Rabbit pAb、SQSTM1/p62 Rabbit pAb、LC3B Rabbit pAb購自ABclonal公司;山羊雌二醇ELISA檢測試劑盒、山羊孕酮ELISA檢測試劑盒購自博諾恒生物科技有限公司。

1.2 試驗動物和細胞培養試驗動物選用西南大學動物科學技術學院試驗羊場的3～4月齡健康大足黑山羊,所有試驗均得到西南大學動物實驗倫理委員會批準。待山羊屠宰后,將卵巢取出用75%酒精噴洗,用無菌PBS緩沖液沖洗3遍,放入37℃無菌生理鹽水中,帶回實驗室進行后續操作。山羊卵泡顆粒細胞的培養同文獻[21]報道。

1.3 miRNA-148a-3p模擬物與抑制劑轉染待細胞在6孔板密度達到70%～80%時按照轉染試劑說明進行操作。5 μL miR-148a-3p mimics/NC、inhibitor/NC和5 μL EndoFectinTMMax轉染試劑用DMEM/F-12稀釋至150 μL,室溫靜置5 min。隨后將上述稀釋的溶液與EndoFectinTMMax溶液混合,輕柔吹打混勻后靜置20 min,等待復合物充分形成。向6孔板中均勻滴加RNA-EndoFectinTM復合物,使其在細胞培養板中均勻擴散。在含有5% CO2的培養箱中于37℃孵育24～72 h后提取細胞總RNA或蛋白進行后續試驗。

1.4 AdPlus-mCherry-GFP-LC3B轉染在24孔板接種細胞后置于培養箱中培養24 h以上,待細胞密度在50%左右時對細胞進行過表達或者抑制miR-148a-3p處理,24 h后吸棄舊培養液,每孔加入300 μL 新鮮培養液,并分別加入40 μL病毒母液。感染24 h后吸棄培養板中含有病毒的培養液,每孔加入500 μL新鮮的完全培養液繼續培養24 h,在適當條件誘導自噬1～2 h后在熒光顯微鏡下觀察LC3B的熒光變化情況。

1.5 CCK8及流式細胞術轉染miR-148a-3p模擬物或抑制劑處理72 h后每孔加入10 μL CCK8溶液,置于細胞培養箱中孵育2 h,用酶標測定儀檢測450 nm處轉染的吸光度值。用胰酶消化收集轉染后的卵巢顆粒細胞,用預冷的PBS清洗細胞2次,1 700 r/min 離心5 min,棄上清,用Binding buffer緩沖液重懸細胞,調整細胞密度為107個/mL。在流式管中加入100 μL細胞懸液,隨后分別加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-AAD輕柔混勻,室溫避光孵育15 min后用流式細胞儀檢測細胞狀態。

1.6 實時熒光定量PCR使用RNAiso試劑(TaKaRa,中國)從顆粒細胞中提取總RNA。使用分光光度計測定RNA質量濃度和純度。根據PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書的要求首先去除基因組DNA,之后進行反轉錄反應。所有基因序列均源自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,合成引物及序列見表1。根據TaKaRa公司的TB Green?Premix Ex TaqTMⅢ(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書,進行熒光定量PCR試驗。反應體系為15 μL:TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 7.5 μL、Forward primer(10 μmol/L)0.6 μL、Reverse primer(10 μmol/L)0.6 μL、模板(cDNA)1.2 μL、RNase Free dH2O 5.1 μL。經過95℃反應30 s、95℃反應5 s、60℃反應30 s的步驟進行40次循環,在63.5℃時檢測熒光信號,溶解曲線依據具體引物可在65℃～95℃范圍內進行調整,每0.5℃時讀取1次反應Ct 值。

表1 PCR引物序列

1.7 總蛋白提取和Western blot依據動物全蛋白提取試劑盒的說明書提取經不同處理的細胞的總蛋白,提取的總蛋白在-80℃冷凍保存。采取BCA法測定蛋白質量濃度,將蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液混合后沸水浴8～10 min,經電泳轉膜等操作,將PVDF膜放入裝有封閉液的培養皿中封閉2 h,結束后過夜孵育對應的一抗,隨后二抗孵育2 h,利用顯影液在照膠儀下觀察蛋白相對表達量。

1.8 ELISA檢測處理結束后收集細胞培養液至新的離心管,3 000 r/min離心10 min后收集上清液。制備50,25,12.5,6.25,3.125,1.562 5,0 mg/L 的標準品,將樣品用標準稀釋液按1∶4稀釋后在96孔中加入50 μL的樣品或不同質量濃度標準品至預包被板孔中。每孔加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μL,用封板膜封閉反應孔,恒溫箱室溫孵育60 min。用300 μL稀釋為1×的洗滌液對96孔板洗滌,每次15～30 s,重復5次,在最后1次洗板結束后將板倒扣于厚吸水紙上拍打使其干燥。各加入50 μL A液和B液,在37℃條件下避光孵育15 min后將終止液50 μL加入96孔板中,立刻用酶標儀在450 nm波長條件下測定光密度值。

1.9 統計分析本試驗使用GraphPad Prism軟件進行統計分析,用獨立t檢驗對兩組數據進行比較分析。試驗重復3次以上,數據結果采用平均值±標準誤表示,P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。

2 結果

2.1 miR-148a-3p轉染效率驗證將miR-148a-3p模擬物與抑制劑及NC轉染到卵巢顆粒細胞中,分別在24,48,72 h觀察細胞轉染情況并用qRT-PCR驗證其轉染效率。由圖1可知,在轉染后72 h,觀察到細胞轉染效率最高。利用qRT-PCR進行mRNA水平檢測,發現轉染miR-148a-3p mimics后72 h 時其在卵巢顆粒細胞中的表達量最高(P<0.01),因此后續試驗選用轉染后72 h的細胞。由于miRNA inhibitor的干擾原理,未檢測到miR-148a-3p表達量的變化。

A.顆粒細胞轉染miR-148a-3p不同時間后的熒光圖(×100);B.轉染后不同時間miR-148a-3p在顆粒細胞中的表達量

2.2 miR-148a-3p對卵巢顆粒細胞增殖的影響利用CCK8法測定細胞增殖活力,結果顯示,轉染后72 h,過表達miR-148a-3p極顯著提高了細胞增殖活力(P<0.01),抑制miR-148a-3p降低了細胞增殖活力(P<0.05)(圖2A)。過表達miR-148a-3p極顯著上調EdU陽性細胞的比例(P<0.01)(圖2B),但抑制miR-148a-3p對EdU陽性細胞的比例無顯著影響(P>0.05)。通過qRT-PCR和Western blot檢測基因的表達水平,結果顯示,過表達miR-148a-3p極顯著上調PCNA mRNA和蛋白的表達量(P<0.01),抑制miR-148a-3p顯著下調PCNA mRNA和蛋白的表達量(P<0.05)(圖2C、D)。流式細胞術結果顯示,過表達miR-148a-3p使G1期細胞占比極顯著降低(P<0.01),處于G2期的細胞占比極顯著增加(P<0.01),但對處于S期細胞的占比沒有影響。抑制miR-148a-3p表達使G2期細胞的占比顯著降低(P<0.05),但對處于G1期和S期細胞的占比沒有顯著影響(圖2E)。qRT-PCR結果顯示,過表達miR-148a-3p后,顯著升高了CCND1的mRNA(P<0.05),但其對CDK4和CCNE1沒有顯著影響(P>0.05);抑制miR-148a-3p對CDK4、CCND1和CCNE1的mRNA水平均無顯著影響(P>0.05)(圖2F)。

A.CCK8檢測轉染miR-148a-3p不同時間對顆粒細胞增殖活性的影響;B.EdU檢測轉染miR-148a-3p后顆粒細胞的增殖情況(×100);C,D.轉染miR-148a-3p后顆粒細胞中PCNA的實時熒光定量及蛋白免疫印跡分析;E.miR-148a-3p對顆粒細胞周期的影響;F.轉染miR-148a-3p后顆粒細胞中CDK4、CCND1和CCNE1的實時熒光定量分析

2.3 miR-148a-3p對卵巢顆粒細胞凋亡的影響使用流式細胞術檢測過表達或抑制miR-148a-3p后顆粒細胞的凋亡情況。結果顯示,過表達miR-148a-3p極顯著下調細胞凋亡率(UR+LR)(P<0.01),由2.18%降低到1.19%,而抑制miR-148a-3p顯著上調細胞凋亡率(UR+LR)(P<0.05),由1.35%升高到8.21%(圖3A,B)。通過qRT-PCR和Western blot檢測顯示,過表達miR-148a-3p極顯著上調Bcl-2/Bax的mRNA和蛋白的表達量(P<0.01)(圖3C,D)。抑制miR-148a-3p對Bcl-2/Bax的mRNA和蛋白的表達無顯著影響(P>0.05)(圖3C,D)。上述結果表明,過表達miR-148a-3p可抑制顆粒細胞凋亡。

A,B.轉染miR-148a-3p后顆粒細胞凋亡情況及定量分析;C,D.轉染miR-148a-3p后顆粒細胞中Bcl-2/Bax的實時熒光定量及蛋白免疫印跡分析

2.4 miR-148a-3p對卵巢顆粒細胞自噬的影響在轉染miR-148a-3p后24 h接種自噬LC3雙標腺病毒,繼續培養后48 h利用熒光倒置顯微鏡觀測miR-148a-3p mimics NC組、miR-148a-3p mimics組、miR-148a-3p inhibitor NC組和miR-148a-3p inhibitor組細胞的自噬體數量。結果顯示,過表達miR-148a-3p顯著增加了自噬體的個數(P<0.05)(圖4A,B),但抑制miR-148a-3p對自噬體的數量無明顯影響。Western blot結果顯示,過表達miR-148a-3p顯著上調LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(P<0.05),但對p62的蛋白表達量無明顯影響,而抑制miR-148a-3p對LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值無明顯影響(P>0.05),但顯著上調p62的表達(P<0.05)(圖 4C)。結果表明,在卵巢顆粒細胞中過表達miR-148a-3p可誘導細胞自噬。

A.用mCherry-GFP-LC3B腺病毒轉染顆粒細胞檢測轉染miR-148a-3p后的自噬水平(×100);B.轉染miR-148a-3p后mCherry-GFP-LC3B的定量分析;C.轉染miR-148a-3p后顆粒細胞中LC3B及P62的蛋白免疫印跡分析

2.5 miR-148a-3p對顆粒細胞分泌類固醇激素的影響使用ELISA試劑盒檢測在顆粒細胞中過表達或抑制miR-148a-3p 72 h時細胞培養液中E2和P4的含量。結果顯示,過表達miR-148a-3p極顯著促進了P4的分泌(P<0.01),而抑制miR-148a-3p則極顯著下調了P4的分泌(P<0.01)。但是過表達和抑制miR-148a-3p都對E2的分泌無顯著影響(P>0.05)(圖5A)。qRT-PCR檢測顯示,在顆粒細胞中過表達miR-148a-3p后3β-HSD的mRNA相對表達量極顯著增加(P<0.01),StAR和CYP11A1的mRNA相對表達量也顯著增加(P<0.05),但其對CYP19A1的mRNA表達無顯著影響。抑制miR-148a-3p對3β-HSD、StAR、CYP11A1和CYP19A1均無明顯影響(圖5B)。Western blot結果顯示,過表達miR-148a-3p顯著上調3β-HSD、StAR、CYP11A1的蛋白表達(P<0.05),但對CYP19A1的蛋白表達無顯著影響。抑制miR-148a-3p對3β-HSD、StAR、CYP11A1及CYP19A1的蛋白表達量均無顯著影響(圖5C)。結果表明,上調miR-148a-3p可促進卵巢顆粒細胞孕酮分泌。

A.ELISA測定轉染miR-148a-3p后顆粒細胞E2及P4的分泌量;B,C.轉染miR-148a-3p后顆粒細胞中3β-HSD、StAR、CYP11A1和CYP19A1的實時熒光定量及蛋白免疫印跡分析

3 討論

miRNA在卵巢顆粒細胞、卵母細胞和卵泡液中表達,影響家畜的繁殖能力。本試驗探究了miR-148a-3p對卵巢顆粒細胞的增殖、凋亡、自噬及類固醇分泌的影響。先前研究發現,miR-148a-3p在調控細胞增殖中起重要作用,如SHANG等[14]發現miR-148a-3p可顯著促進內皮細胞的增殖;LIU等[15]發現在腎小球中過表達miR-148a-3p可顯著促進PCNA表達和細胞增殖。本研究結果與先前研究結果一致,發現過表達miR-148a-3p可促進PCNA在mRNA及蛋白水平的表達,促進卵巢顆粒細胞的增殖。進一步利用流式細胞術研究發現,miR-148a-3p能降低G1期細胞的比例,同時升高G2期細胞的比例。過表達miR-148a-3p可上調CCNE1的表達量,而CCNE1的主要功能是促使細胞進入S期,但本研究結果中S期細胞的比例未見增加,可能是細胞經過S期合成了DNA,進入了G2期。在顆粒細胞中過表達miR-148a-3p后G2期細胞比例增多,可能是完成S期后等待進入M期進行有絲分裂的細胞增多。以上結果表明miR-148a-3p可能通過上調CCNE1的表達促進細胞及時從G1期進入S期,從而促進卵巢顆粒細胞的增殖。

有研究顯示,大多數miRNA在哺乳動物卵巢顆粒細胞凋亡中發揮著促進作用。如ZHANG等[16]發現,小鼠卵巢顆粒細胞中miRNA-122-5p通過調節BCL9促進細胞凋亡;但也有研究顯示,miRNA對細胞凋亡有抑制作用,如ZHU等[17]發現,miR-222通過靶向THBS1基因來抑制豬卵巢顆粒細胞的凋亡。本研究通過流式細胞術、qRT-PCR及Western blot檢測轉染miR-148a-3p后卵巢顆粒細胞的凋亡率及Bcl-2和Bax的表達量。發現卵巢顆粒細胞中過表達miR-148a-3p下調細胞的凋亡率,同時上調Bcl-2/Bax數值;說明過表達miR-148a-3p可抑制卵巢顆粒細胞凋亡。

自噬是一種從酵母到哺乳動物都存在的保守機制,對生長發育等一系列生理過程有重要作用。盡管之前研究發現了顆粒細胞自噬對卵泡生長或閉鎖的作用,但自噬在卵巢顆粒細胞中的具體作用及其機理仍不清楚。已有研究發現miR-148a-3p對自噬有調控作用,如LI等[18]發現在胃癌細胞中過表達miR-148a-3p會抑制細胞自噬。本研究利用qRT-PCR及Western blot檢測了轉染miR-148a-3p后卵巢顆粒細胞自噬情況及自噬相關基因LC3B、P62的表達量。結果發現在卵巢顆粒細胞中過表達miR-148a-3p上調自噬體的數量以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值,說明過表達miR-148a-3p可誘導卵巢顆粒細胞自噬。

顆粒細胞是類固醇激素合成和分泌的主要來源,大量研究探究了miRNA影響顆粒細胞類固醇激素分泌的分子途徑。如GAO等[19]發現miR-31靶向HSD17B14和FSHR,miR-20b靶向HSD17-B14,以影響豬卵巢顆粒細胞的凋亡和類固醇激素分泌。本研究利用ELISA、qRT-PCR及Western blot檢測了E2、P4的分泌量和類固醇合成相關基因3β-HSD、StAR、CYP11A1和CYP19A1的表達量。結果發現在顆粒細胞中過表達miR-148a-3p使得P4的分泌量增加,并且上調了3β-HSD、StAR和CYP11A1的表達量,但不影響E2的分泌。

本研究中,抑制miR-148a-3p表達,沒有下調EdU陽性細胞率,對Bcl-2/Bax的mRNA和蛋白表達也沒有影響。相比較過表達miR-148a-3p能顯著促進自噬水平,抑制miR-148a-3p并沒有抑制自噬水平,抑制miR-148a-3p對類固醇合成相關基因3β-HSD、StAR、CYP11A1和CYP19A的表達也沒有抑制作用。miR-148a-3p調控細胞增殖的靶基因和通路有很多,如miR-148a-3p通過調節DNMT1和UTF1的表達抑制宮頸癌細胞的增殖[20];miR-148a-3p通過靶向周期蛋白依賴性激酶6(CDK6)抑制急性髓細胞增殖[21]。當單獨抑制某個基因或通路時,可能還會有其他的基因在起作用,不會造成顯著的影響。因此,miR-148a-3p在卵巢顆粒細胞中具體通過哪些通路和途徑調控細胞增殖還有待于進一步研究。

綜上所述,本研究證明過表達miR-148a-3p可促進卵巢顆粒細胞增殖,抑制凋亡,誘導卵巢顆粒細胞自噬,促進孕酮的分泌,但不影響雌二醇的分泌。本研究為進一步了解miRNA調控卵巢顆粒細胞的生理功能提供了一定的理論基礎。