樹突狀細胞(DCs)交叉遞呈疫苗抗原分子途徑研究進展

楊蘇珍,劉運超,尚延麗,張改平,2,3*

(1.河南省農業科學院 動物免疫學重點實驗室,河南 鄭州 450002;2.河南農業大學 牧醫工程學院,河南 鄭州 450000;3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心,江蘇 揚州 225009)

探索抗原遞呈和免疫應答的分子機制,研制安全、高效的豬用疫苗和佐劑,做好豬病防控對穩定生豬養殖業健康發展和肉類食品供應具有重要意義。理想的疫苗應該在保證安全的前提下,同時激活體液免疫反應和細胞免疫反應,進而產生快速而持續的免疫保護。疫苗免疫動物機體后通過固有免疫系統和適應性免疫系統做出免疫應答,起到免疫保護作用。固有免疫系統包括單核/巨噬細胞、天然殺傷細胞(NK)、樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)、粒細胞和先天類T細胞等。這些免疫細胞在激活后可直接執行免疫清除作用或通過分泌細胞因子,如IFN-g等,在刺激體液免疫應答和免疫調控中發揮重要作用。DCs是專職抗原遞呈細胞(antigen presenting cells,APC),能有效地誘導CD8+T淋巴細胞的免疫應答。通常,外源抗原經過DC細胞遞呈的MHCⅡ途徑可激活體液免疫應答,經過交叉遞呈MHCⅠ途徑,外源抗原能夠激活細胞毒性T淋巴細胞( cytotoxic T lymphocytes,CTL)起到清除感染細胞的作用。現從疫苗設計角度對豬樹突狀細胞(DCs)介導的交叉遞呈外來抗原的分子機制進行綜述。

1 DCs介導的抗原交叉遞呈概述

DCs是目前已知功能最強大的APC,它能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原,成熟DCs能有效激活初始T細胞,處于啟動、調控、并維持免疫應答的中心環節[1]。通常情況下,內源性抗原,如病毒感染宿主細胞產生的病毒抗原以及細胞基因突變后產生的腫瘤抗原等,被DCs攝取后進入主要組織相容性復合體Ⅰ(major histocompatibility complexⅠ,MHCⅠ)遞呈途徑,刺激CD8+T細胞活化,成為細胞毒性T淋巴細胞(CTL),直接參與病毒清除。外源性抗原,如滅活疫苗和亞單位疫苗中的蛋白抗原,經DCs處理后通常會通過主要組織相容性復合體Ⅱ(major histocompatibility complexⅡ,MHCⅡ)遞呈途徑,結合MHCⅡ的多肽抗原可以被抗原特異性CD4+T細胞識別,激活輔助性T細胞(helper T cells,Th),啟動B細胞免疫應答[2]。但是,在某些情況下,外源性抗原可以進入MHCⅠ類分子遞呈途徑,激活CD8+T細胞,啟動CTL反應,這一遞呈途徑被稱為抗原交叉遞呈(cross-presentation)[3]。交叉遞呈對外源性抗原激活CTL,促進B細胞和T細胞免疫協同應答,進而引發抗腫瘤、抗病毒免疫反應有重要意義。

抗原通過經典的抗原遞呈途徑和交叉遞呈會分別啟動不同的免疫應答模式,兩種遞呈途徑的分子機制也存在較大差異[4]。經典MHCⅡ抗原遞呈途徑,內化的抗原分子在內體(endosome)或溶酶體內被蛋白酶(如組織蛋白酶)降解成多肽。新合成的MHCⅡ分子通過與不變鏈(invariant chain,Ii,CD74)結合保持穩定,并從內質網被轉運到內體或溶酶體隔室,Ii被溶酶體內蛋白酶降解為CLIP(與MHC類分子穩定相聯的最小的Ii片段),MHCⅡ分子與CLIP結合。隨后,來自于抗原加工的多肽在伴侶蛋白HLA-DM(human leukocyte antigen DM)的協助下取代CLIP與MHCⅡ結合,進而展示在細胞表面,激活Th細胞,主要參與B細胞免疫應答[5-6]。在交叉遞呈途徑,外源性抗原通過進入細胞后以另一種方式進行加工和遞呈,激活CD8+T細胞免疫應答。

許多細胞能夠遞呈外源抗原到MHCⅠ類分子激活CD8+T淋巴細胞,但DCs是最主要的交叉呈遞細胞[8]。DCs分為傳統的DCs(classic or tissue-resident DCs,cDCs)和漿細胞樣DCs(plasmacytoid DCs,pDCs),cDCs進一步被分為cDC1和cDC2[9]。在小鼠和人體內,cDC1以趨化因子受體XCR1的表達為特征,其發育依賴于轉錄因子IRF8和Batf3的表達,而cDC2的發育主要受IRF4的調控[10]。cDC1被認為是一種高效的交叉呈遞細胞,小鼠cDC1表達CD8(在淋巴組織中)或CD103(在非淋巴組織中),而人類cDC1表達BDCA-3(CD141)。因此,在小鼠淋巴組織中,和細胞相關的可溶性抗原通過駐留在淋巴組織的CD8+DCs交叉遞呈,而在肺、腸道和皮膚的抗原則通過遷移的CD103+DCs實現交叉遞呈[11]。

單核細胞來源的DCs(monocyte-derived DCs,MoDCs)也稱為炎性DCs,在疫苗刺激的獲得性免疫應答中發揮重要作用。在動物的外周血、肌肉和皮下組織中含有大量的單核細胞,這些單核細胞可以分化為向CD4+和CD8+T細胞呈遞抗原的MoDCs[12]。在缺乏炎癥的情況下,腸道、肌肉和皮膚等外周組織中也發現了MoDCs,研究顯示MoDCs表達轉錄因子ZBTB46[13]。在病原體誘導或疫苗接種的情況下,募集到炎癥部位的單核細胞原位分化成表達CD11c、MHCⅡ/Ⅰ等的MoDCs,發揮抗原遞呈或交叉遞呈作用,啟動獲得性免疫應答反應[14]。MoDCs可以進行交叉遞呈和MHCⅡ限制性遞呈,并且可以根據炎癥環境誘導Th1、Th2或Th17應答[15]。有研究顯示,在疫苗接種環境中,MoDCs促進抗原特異性T細胞產生和濾泡輔助性T細胞分化,在特異性免疫應答和免疫記憶中發揮重要作用[16]。在體外,血液中的單核細胞在粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和白細胞介素4(IL-4)的共同刺激下分化成MoDCs,表面標志物為CD1、CD14、CD16、CD80/86、CD1721、MHCⅠ和MHCⅡ等[12,17]。高效的疫苗能夠通過誘導交叉遞呈同時激活T細胞免疫應答和B細胞免疫應答,充分理解DCs介導的交叉遞呈分子機制,對理解疫苗的起效機制,開發高效的豬用疫苗和佐劑具有重要的指導意義。

2 MoDCs交叉遞呈外源性抗原的途徑

交叉遞呈外源性抗原的分子途徑主要有內體-胞質途徑(endosome-to-cytosol pathway)、液泡途徑(vacuolar pathway),以及縫隙連接途徑(gap junction pathway)[18]。

2.1 內體-胞質途徑內體-胞質途徑是最早被發現的抗原交叉遞呈途徑,顆粒性抗原通過巨噬細胞誘導的CD8+T細胞反應依賴于蛋白酶體、抗原加工相關轉運體(transporter associated with antigen processing,TAP)和內質網-高爾基體轉運通路,但是不依賴溶酶體[19-20]。這一通路也參與可溶性抗原的交叉遞呈[21]。在內體-胞質途徑中,外源抗原被DCs內化形成吞噬泡,吞噬泡與早期內體融合,抗原在轉運復合體SEC61協助下從內體轉運到細胞質溶液中,并在細胞質內被蛋白酶降解成多肽[22]。事實上,在抗原由內體轉運到胞質之前先進行了去蛋白折疊和部分水解。抗原一旦定位于胞質內,就會被泛素化進而靶向蛋白酶體。隨后,這些多肽被TAP轉運到內質網或者回到內體,并在內質網或內體中被裝載到MHCⅠ,隨后MHCⅠ多肽復合體被轉運到DCs表面[23]。被轉運到內質網的多肽在內質網與MHCⅠ結合,隨后經內質網-高爾基體途徑轉運到高爾基體,并從高爾基體轉運到細胞膜。但是被轉運回到內體的多肽在內體與來自內質網的MHCⅠ結合,并最終被轉運到細胞膜(圖1)[24]。盡管有大量證據顯示,某些抗原確實可以不依賴于蛋白酶降解和TAP介導的肽轉運而通過液泡途徑進行抗原交叉遞呈,但是大部分的交叉遞呈都是通過內體-胞質途徑實現的[25]。

A.MoDC細胞經液泡途徑交叉遞呈抗原示意圖;B.MoDC細胞經內體-胞質途徑交叉遞呈抗原示意圖

2.2 液泡途徑除了內體-胞質途徑,還存在另一種對蛋白酶抑制劑和TAP抑制劑不敏感的途徑,不依賴于胞質的抗原降解活性,即液泡途徑。在液泡途徑中,抗原被DCs吞噬,進入內體,隨后在內體中被組織蛋白酶(cathepsin S,Cat S)降解成短肽片段,短肽片段被裝載到細胞表面的MCHⅠ,最后MCHⅠ-多肽復合體通過早期內體相關的液泡轉運到DCs表面。抗原的加工和裝載于MHCⅠ分子發生在內體或溶酶體區。在液泡途徑中,由于內體和蛋白酶體的水解作用能夠被亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64和蛋白酶抑制劑Z-FA-FMK所抑制,因此這種水解作用被認為是半胱氨酸酶在發揮作用,尤其是Cat S;相反,蛋白酶抑制劑胃蛋白酶A對液泡交叉遞呈的影響很小[3]。液泡途徑在顆粒性抗原和細胞相關抗原的交叉遞呈中發揮重要作用,包括那些重組融合蛋白、多聚物修飾形成的聚合蛋白和VLPs等,以及非顆粒性抗原,如OVA抗原和腫瘤來源的多肽抗原等[11]。隨著豬瘟E2蛋白亞單位疫苗、豬偽狂犬亞單位疫苗和口蹄疫病毒病毒樣顆粒疫苗等通過上市或臨床試驗審批,基因工程亞單位疫苗成為未來豬病疫苗的一個重要研發方向,深入研究抗原交叉遞呈的液泡途徑對開發新型豬用基因工程亞單位疫苗具有重要意義。

2.3 縫隙連接途徑另有一種研究較少的交叉遞呈途徑,縫隙連接途徑(gap junction pathway),受病毒感染或者病變細胞的抗原多肽分子通過縫隙連接進入DCs的胞質,并被轉運到粗面內質網與MHCⅠ結合,隨后被轉運到細胞表面[26]。細胞間的縫隙連接由高度有序化的Cx43組成,是重要的細胞通訊方式,允許細胞間各種分子交換,縫隙連接途徑主要遞呈來自相鄰細胞的抗原[27]。

DCs交叉遞呈激活CTL的過程對抗病毒和抗腫瘤免疫治療至關重要,抗原交叉遞呈能夠激活抗原特異性CTL,這些CTL向感染部位遷移后具備殺死潛在靶細胞的能力,例如病毒感染細胞和腫瘤細胞。在當前生豬養殖業面臨巨大疫病防控壓力的情況下,利用豬抗原交叉遞呈的分子機制或為非洲豬瘟等重大動物疫病疫苗設計的關注點。

3 影響抗原遞呈的因素

DCs的交叉遞呈存在多種機制,抗原進入DCs方式和抗原在內體的定位是影響抗原交叉遞呈的重要因素。DCs內吞抗原是抗原遞呈的開始,內吞效率在免疫應答調節中扮演重要角色。不同的內吞機制決定了抗原降解的差異,導致抗原遞呈效率差異。研究顯示,用來內化抗原的內吞作用受體決定了抗原的內吞路線和降解途徑[28]。由胞飲作用或清道夫受體介導的抗原內化后迅速靶向溶酶體,被溶酶體蛋白酶有效降解,導致抗原交叉遞呈降低。然而,如果由DCs通過甘露糖受體(mannose receptor,MR)內化相同的抗原,則其靶向的是一個不同的早期內體池,這些內體不與溶酶體快速融合,且抗原在內體中受到保護不被降解,從而導致甘露糖受體內化抗原的有效交叉遞呈[29]。

3.1 抗原進入DCs的方式抗原進入DCs的方式對抗原遞呈有著重要的影響。通常情況下,細胞的內吞作用可以分為吞噬作用(phagocytosis)和胞飲作用(pinocytosis)。在哺乳動物中有3種白細胞具有吞噬作用,它們是巨噬細胞、嗜中性粒細胞(neutrophils)和DCs,這些細胞能通過吞噬作用吞噬侵入機體的病原微生物。胞飲作用發生在幾乎所有的真核細胞中,是一種快速的內吞作用。細胞胞飲作用的內吞機制可以分為4種:(1)網格蛋白型內吞途徑(clathrin-dependent endocytosis,CDE);(2)小窩蛋白依賴的內吞途徑(caveolae-dependent endocytosis,CaDE);(3)網格蛋白、小窩蛋白非依賴型內吞途徑(the non-clathrin-,non-caveolae-dependent pathways)和(4)巨胞飲作用(macropinocytosis)[30]。藥理阻斷是研究細胞內吞作用的常用方法,許多藥物可以阻斷細胞內吞作用,針對細胞內吞方式的認知主要來自藥物阻斷的研究成果。氯丙嗪 (chlorpromazine,CPZ)可引起網格蛋白網絡在內體膜上的組裝并阻止細胞內表面上的被膜小窩組裝,進而抑制網格蛋白介導的內吞作用,因此常被用來研究網格蛋白在某種抗原內吞過程中的作用[31]。同樣,甲基-β-環糊精(MβCD)、制霉菌素等可通過減少或隔離膽固醇抑制脂筏/胞膜窖介導的內吞作用[32];鹽酸阿米洛利(amiloride)可通過抑制Na+/H+交換,進而抑制巨胞飲作用[33];細胞松弛素D(cytochalasin D)可通過抑制肌動蛋白的聚合反應,從而抑制吞噬作用和巨胞飲作用;Dynamin作為一種GTPase對包括CDE、CaDE以及網格蛋白和小窩蛋白獨立的內吞作用途徑都是必不可少的,而Dynasore(C18H14N2O4)可通過抑制動力蛋白Ⅰ和Ⅱ的GTP酶活性抑制Dynamin依賴的內吞途徑[33]。不同種類的抗原,甚至同一類抗原因聚集形態、電荷分布等的差異也會引起內吞方式和效率的不同,進而引起交叉遞呈和免疫應答的差異。

3.2 抗原在DCs的定位抗原在DCs的定位對抗原遞呈有著重要的影響。內體是抗原的儲藏室,抗原在內體的穩定性以及內體本身的穩定性都對抗原遞呈和免疫應答強度有著重要的影響。內體是細胞內吞作用運載途徑的一個區室,提供了細胞外物質進入細胞內的運載途徑[34]。很多病毒抗原首先與細胞膜吸附,其后被細胞內吞囊泡包裹進入細胞與內體融合,進入抗原遞呈途徑。不同時期內體的超微結構、密度、pH、所含酶類、MHC分子濃度存在差異。根據細胞內吞作用的不同時間階段,可以將內體分為早期內體(early endosome)、晚期內體(late endosome)以及再循環體(recycling endosome)。一旦在內吞作用中的囊泡被釋放,它們首先與初級內體融合,之后再成長為次級內體并與溶酶體融合。初級內體成長形成次級內體,其酸度通過V-ATPase的活動而增加,其大小通過融合同類型的內體成為更大的囊泡而增加,次級內體或以多泡體(multivesicularbody,MVB)的形式呈現。最終,次級內體釋放RAB5而獲取RAB7,為其與溶酶體的融合做好準備[35]。早期內體包含囊泡-小管網絡,囊泡的直徑可大至1 μm,周圍連接著直徑大約50 nm的小管。標記物包括運鐵蛋白RAB5,RAB4和它的運鐵蛋白受體以及EEA1。晚期內體也被稱為多泡體,形態為球形,管狀結構較少,主要包含密集的空腔狀囊泡,標記物包括RAB7,RAB9以及M6P受體[3]。再循環內體主要集中在微管組織中心,包含管網結構,標記物為RAB11。

3.3 抗原的駐留時間抗原的降解過程影響抗原交叉遞呈效率。抗原的快速降解會在抗原被適當的加工和裝載到MHCⅠ之前其表位被迅速而大量的破壞[36]。此外,負載多肽的MHCⅠ分子在細胞膜上的壽命有限,因此,使DCs在向淋巴結遷移后能夠持續而高效的活化T細胞,持續的向DCs表面轉運MHCⅠ抗原復合物,同時延長復合物在DCs表面展示的時間對CTL激活非常重要[37]。在小鼠的CD8a+DCs中,轉錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)可以促進溶酶體的成熟和溶酶體蛋白酶活化,是交叉遞呈的重要負向調控因子。因此,APC中限制抗原降解可能是一種產生細胞內抗原庫的機制[38]。這種機制確保了抗原庫(溶酶體或內體)中的抗原可以被持續加工和呈遞,進而保證負載多肽的MHCⅠ分子在細胞表面較長時間的存在,保證對T細胞的連續刺激。這種細胞內抗原儲存庫也出現在人類單核細胞中,這些長肽段抗原可以在單核細胞的非溶酶體間室中積累超過5 d而不會迅速降解[39]。

4 展望

我國養豬業的疫情防控形勢復雜嚴峻,新型疫苗研發如火如荼,但目前對疫苗抗原分子交叉遞呈途徑研究的針對性和系統性不足,導致T細胞疫苗研究缺乏理論指導和技術支撐,影響疫苗免疫效力的提升和新型疫苗產品的開發。隨著外源性抗原交叉遞呈分子途徑及相關影響因素研究的深入,對于疫苗抗原經MoDC細胞交叉遞呈的途徑和影響T細胞免疫激活相關因素的認知逐漸豐富,為疫苗T細胞免疫效力提升和新型亞單位疫苗的開發提供了新的思路。DCs交叉遞呈異源抗原分子是疫苗抗原啟動T細胞免疫應答的主要途徑,深入理解抗原交叉遞呈分子機制和影響因素,對設計T細胞疫苗抗原,促進疫苗在誘發體液免疫和細胞免疫方面的協調作用,具有重要的指導意義。近年來,豬細小病毒病毒樣顆粒疫苗(PPV VLPs)[40-41]、豬圓環病毒(PCV)亞單位疫苗、犬細小病毒[42]和禽法氏囊病毒亞單位疫苗[43]等新型亞單位疫苗的研究發展迅速,開展疫苗抗原交叉遞呈途徑的探索性研究對高效疫苗抗原設計和疫苗產品開發具有重要指導意義。