四川牦牛ACOT12基因多態性及其與肉品質性狀的相關分析

阮夢茹,王浩鑄,謝 濤,陸惠嫻,于海濱,姜 平*,趙志輝,2*

(1.廣東海洋大學 濱海農業學院,廣東 湛江 524000;2.粵西地區畜禽資源與種質創新重點實驗室,廣東 湛江 524000)

牦牛屬于大型反芻動物,體格高大、被毛厚密,心肺功能發達,抗逆性強,是唯一起源于青藏高原且在高海拔地區繁衍至今的珍稀牛種[1]。具有高海拔地區適應能力強、耐粗飼、抗寒耐勞等優良特性。與普通黃牛肉相比,牦牛肉的蛋白質含量高達22.52%,脂肪含量約為3.15%,且礦物質元素含量豐富,氨基酸結構比例與人更相近,有著較高的營養價值與經濟價值[2]。截至2019年全世界牦牛總數量約為1 700萬頭,其中中國牦牛存欄數為1 600多萬頭,占比90%以上[3],主要分布于青海、四川、西藏等地區。牦牛肉的高經濟價值,改善了人們的生活環境與膳食結構,因此推動牦牛產業的發展,對加強經濟建設有著重要意義。隨著科學技術的進步,人們對分子遺傳育種的知識更加完善,有關分子標記的研究日益增多,單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)是分子標記最常用的方法之一,SNP是基因組水平上單個核苷酸變異所導致的DNA堿基序列的多態性[4],可用于快速基因型分型,是研究遺傳育種相關的分子標記常用的技術之一。

酰基輔酶A硫脂酶(acyl-CoA thioeaterase,ACOT)是一類水解酶,可催化酯酰輔酶A水解成自由脂肪酸和輔酶A,廣泛存在于哺乳動物組織中[5]。目前已知的ACOT家族成員有15個[6],根據酶的相對分子質量大致被分為Ⅰ型和Ⅱ型,兩種類型的ACOT無結構相似性和序列同源性,因此被稱為類似物而非同系物。Ⅰ型和Ⅱ型ACOT均含有保守的催化三聯體氨基酸序列,該序列在催化反應和調節酶活性中發揮重要作用。酰基輔酶A硫脂酶12(acyl-CoA thioeaterase 12,ACOT12)是ACOT家族Ⅱ型酶成員之一,主要在肝、腎和小腸中表達[7]。ACOT12基因相關的研究主要集中在小鼠、大鼠和人上。有研究表明,在大鼠中,饑餓和過氧化物酶體增殖等代謝刺激可誘導ACOT12的表達,再次喂食和施加胰島素可降低ACOT12的表達[8]。ACOT12基因與牦牛相關的研究未見報道,本課題組在前期進行的轉錄組學分析中發現,ACOT12是影響牛肉質代謝的差異表達基因。因此本試驗采用DNA測序技術研究四川牦牛ACOT12基因的多態性,并應用SPSS 23.0軟件分析SNPs位點及其單倍型與肉品質性狀的相關性,以期為優質肉牛的早期選育提供理論依據,為構建高品質肉質性狀的核心牛群奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品所選用的102頭四川牦牛,在相同的飼養條件下飼養于四川阿壩州某牛場,收集每頭牛相同部位的頸靜脈血液經抗凝劑處理后,于-80℃ 保存。

1.2 主要試劑血液基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;Green Taq PCR Mix、TAE Buffer購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;DL2000 DNA Marker購自北京寶日醫生物技術有限公司;瓊脂糖購自北京鼎國生物技術有限公司;DNA Loading Buffer、核酸染色劑購自Meilunbio公司。

1.3 主要儀器PCR擴增儀購自Bio-Rad公司;電子天平購自梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司;電泳儀購自北京六一生物科技有限公司;凝膠成像分析儀購自廣州譽維生物科技儀器有限公司;微量分光光度計購自Thermo公司。

1.4 DNA提取按說明書使用血液基因組DNA提取試劑盒提取四川牦牛血液樣本DNA,使用微量分光光度計檢測DNA的質量濃度和純度,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量。

1.5 引物設計根據Ensembl中公布的牛ACO-T12基因序列(ENSBTAT00000014753.6),利用Primer Premier 5.0軟件設計1對引物,引物序列為F:5′-ATGGGAGGAGTGATTGC-3′和R:5′-CCTGACTTCTGCCTTACTGA-3′,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.6 PCR擴增及產物測序以四川牦牛血液DNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增體系(總體積為20 μL):Taq PCR Mix 10 μL,上、下游引物各 0.5 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 7 μL。PCR擴增程序:95℃預變性5 min;95℃變性30 s,52.6℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35個循環;72℃再延伸5 min。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并確認目的條帶正確后,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.7 數據的統計分析采用SeqMan軟件觀察重疊峰;使用Popgene 32軟件計算等位基因的基因頻率、基因型頻率、遺傳雜合度(H)、有效等位基因數(Ne);使用PIC 0.6軟件計算多態信息含量(PIC);使用Haploview 4.2軟件進行連鎖不平衡分析;使用SPSS 23.0軟件的單因素方差中的多重比較對四川牦牛肉品質性狀和基因型間的關系進行差異顯著性檢驗,以P<0.05作為差異顯著性的判斷標準。試驗數據用“平均值±標準誤”表示。

2 結果

2.1 PCR擴增PCR擴增結果如圖1。擴增產物大小為845 bp,電泳條帶明亮、清晰,無引物二聚體、抹帶和非特異性擴增條帶,可用于后續的測序試驗。

M.DL2000 DNA Marker;1～9.ACOT12基因PCR擴增產物

2.2 PCR擴增產物測序對測序結果進行分析發現,在ACOT12基因的5′UTR和外顯子1上共發現3個SNPs位點,分別為E1-285 T>C、E1-603 T>A、E1-675 C>G,不同基因型的測序圖譜如圖2～4所示。

圖2 ACOT12基因E1-285 T>C位點3種基因型的測序圖譜

圖3 ACOT12基因E1-603 T>A位點3種基因型的測序圖譜

圖4 ACOT12基因E1-675 C>G位點3種基因型的測序圖譜

2.3 ACOT12基因的3個SNPs位點的群體遺傳特性ACOT12基因的3個SNPs位點的群體遺傳特性見表1。由表1可以看出,E1-285 T>C、E1-603 T>A、E1-675 C>G中優勢基因型分別為TC、TA、CC,優勢等位基因分別為T、A、C,頻率均大于0.5;E1-285 T>C、E1-603 T>A位點的遺傳雜合度(H)和多態信息含量(PIC)均處于0.25～0.50之間,表明以上位點呈現為中度多態。χ2檢驗說明,3個SNPs位點在四川牦牛群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05)。

表1 ACOT12基因的3個SNPs的群體遺傳特性分析結果

2.4 ACOT12基因的SNPs與四川牦牛肉品質性狀的相關分析ACOT12基因的3個SNPs與四川牦牛肉品質性狀的相關分析見表2。由表2可以看出,E1-603 T>A位點的TT基因型個體的pH45 min值顯著低于TA、AA基因型個體(P<0.05);E1-675 C>G位點的CG基因型個體的背膘厚顯著高于CC基因型個體(P<0.05),3個SNPs位點的不同基因型與pH24 h、肉色(L*,a*,b*)均無顯著相關性(P>0.05)。

表2 ACOT12基因3個SNPs位點與四川牦牛肉品質性狀相關性分析

2.5 ACOT12基因SNPs的單倍型與四川牦牛肉品質的相關性分析由圖5可知,3個SNPs位點存在強連鎖遺傳,并構成了一個結構域,圖5A表示SNPs位點之間的連鎖程度,數值為D′值,常用來度量連鎖不平衡;圖5B代表3個位點之間組成的5種單倍型的頻率,共組成15種單倍型組合,其中7種單倍型組合具有生物學統計意義(n≥3),分別為H1H1(CC-TT-CC)、H1H2(TC-TA-CC)、H1H3(TC-TA-CG)、H1H4(TC-TT-CC)、H2H2(TT-AA-CC)、H2H3(TT-AA-CG)和H3H3(TT-AA-GG)。由表3可知,H2H2單倍型組合的pH45min值顯著高于H1H4(P<0.05),其他單倍型組合與背膘厚、pH24h值和肉色無顯著差異(P>0.05)。

表3 四川牦牛ACOT12基因的單倍型與肉品質的相關性分析結果

A.3個SNPs位點的連鎖不平衡的熱圖(格子中數值為R2值);B.5種單倍型的頻率

3 討論

中國牦牛屬肉乳役兼用牛,產乳量高,產肉性能比普通牛品質優異,且能適應高海拔地區的惡劣天氣,在提高肉產量及提升肉品質上有著巨大的潛能。如何提高牦牛肉的質量和產量已成為畜牧業生產中不可忽視的問題。近年來,有關ACOT12基因與牛相關的研究較少,其主要研究方向集中于人類醫學方面。邢建曉等[9]研究表明,ACOT12的突變頻率與皮膚慢性炎癥性疾病銀屑病顯著相關,在1 027個樣本中非銀屑病個體中的突變頻率較高;LU等[10]研究表明,ACOT12調節HCC細胞中的細胞乙酰輔酶A水平和組蛋白乙酰化,并且通過下調ACOT12誘導TWIST2表達和促進上皮-間充質轉化從而促進肝細胞癌(HCC)轉移,表明ACOT12與肝癌轉移和肝癌患者的不良生存密切相關。目前SNP在牛育種的研究中應用廣泛,但有關ACOT12基因與四川牦牛肉質性狀關聯的研究尚未見報道。因此本研究使用直接測序法對102頭四川牦牛進行SNP篩選及其與肉品質性狀的關聯分析。

四川牦牛ACOT12基因的群體遺傳特性分析顯示,E1-285 T>C、E1-603 T>A位點的遺傳雜合度(H)和多態信息含量(PIC)均處于0.25～0.50之間,表明以上位點呈現為中度多態。3個SNPs位點在四川牦牛群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05),表明個體受到人工選擇的影響較小,群體遺傳性較好。

動物宰后糖酵解速度快,乳酸含量增加,造成肌肉pH值下降,pH值可直接影響嫩度、肉色、蒸煮損失和保存期,是衡量肉質酸化的重要指標[11]。pH值常用簡便快捷的pH值計測定,宰前牛肉為中性,隨著宰后時間的增加,pH值下降,從而導致肉色變差,持水力下降。背膘厚可客觀、科學地評判某一個體的生長發育狀況,成為評判個體質量優劣的依據,在畜牧業生產中有著重要意義[12],在評估屠宰加工、檢驗飼喂成效和生產育種上也有著重要作用。四川牦牛ACOT12基因E1-603 T>A位點的TT基因型個體的pH45 min值顯著低于TA、AA基因型個體,一般認為宰后肌肉長時間維持較高的pH值,則說明肌肉持水力強,食用品質好。因此TA、AA基因型個體的pH45 min優于TT基因型個體。突變純合型AA基因型是該位點的優勢基因型,因此可推測ACOT12基因有關pH45 min的優勢性狀可在日后的基因突變中得到穩定遺傳;E1-675 C>G位點的CG基因型個體的背膘厚顯著高于CC基因型個體,有研究表明,背膘厚與優質肉重呈負相關[13-14],但對繁殖性能具有一定正向影響[15]。pH45 min值、背膘厚是衡量牛肉質的重要檢測指標,可直接用于判斷肉質的風味和口感,因此以上2個SNPs位點可作為四川牦牛肉質性狀的相關分子標記。

本研究使用Haploview 4.2軟件對ACOT12基因的多態性位點進行連鎖不平衡分析(linkage disequilibrium,LD),LD又稱等位基因關聯,可用于評估連鎖不平衡的程度[16],隨著科學的發展其應用越來越廣泛,在疾病的預測和治療中發揮著重要作用[17]。LD分析發現3個位點存在強連鎖遺傳,并構成了1個結構域,共有15種單倍型組合,其中7種單倍型組合具有生物學統計意義。單倍型組合與肉品質性狀的相關分析發現,H2H2單倍型組合的pH45 min值顯著高于H1H4,因此H2H2單倍型組合是pH45 min性狀的最優單倍型組合。

綜上所述,四川牦牛ACOT12基因的3′UTR和外顯子1上共存在3個SNPs位點,分別為E1-285 T>C、E1-603 T>A、E1-675 C>G,其中E1-603 T>A、E1-675 C>G位點分別與pH45 min值、背膘厚性狀顯著相關,說明以上2個SNPs可作為四川牦牛宰后pH45 min和背膘厚性狀的相關分子標記;H2H2單倍型組合的宰后pH45 min值高于其余單倍型組合,因此可作為四川牦牛宰后pH45 min值性狀的最優單倍型組合,為未來優質肉牛早期選育提供分子理論依據。