鎘脅迫下α-硫辛酸對大鼠腎細胞MAPK信號通路的影響

羅通旺,李卓悅,王曉杜,邵春艷,宋厚輝

(浙江農林大學 動物科技學院/動物醫(yī)學院 浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應用技術研究重點實驗室/動物健康互聯(lián)網檢測技術浙江省工程實驗室/動物醫(yī)學與健康管理浙江省國際科技合作基地/中澳動物健康大數據分析聯(lián)合實驗室,浙江 杭州 311300)

鎘(Cd)是環(huán)境中分布廣泛且毒性很強的一種重金屬污染物,它的生物半衰期長而且排泄率低,容易在動物體內蓄積[1-2]。Cd對生物體的損傷已在大量研究中被證實[3-5],當Cd蓄積到一定程度時會抑制細胞中ATP的活力并導致組織發(fā)生氧化損傷,從而引發(fā)相關疾病[6-7]。目前,Cd中毒的機制還沒有完全闡明,而且對Cd造成的毒性損傷也沒有確切、有效的治療方法。腎臟作為Cd在生物體內最主要的靶器官和蓄積部位,研究Cd暴露導致的腎臟損傷機制和防治方法具有非常重要的臨床意義。

絲裂原活化蛋白激酶( MAPK )信號通路是生物體內重要的信號轉導系統(tǒng)之一,參與介導細胞生長、分裂和凋亡等多種生理及病理過程[8-10]。哺乳動物細胞中 MAPK 有3個主要的家族成員,分別為 ERK1/2、JNK和p38 MAPK[11-12],當通路被激活時,ERK1/2、JNK和p38蛋白的磷酸化水平將升高。根據已報道的文獻以及本實驗室前期的研究表明,MAPK信號通路在Cd誘導的細胞損傷和死亡中能夠被激活并參與了細胞的自噬和凋亡等[13-15],但其作用機制還不是很明確。

α-硫辛酸(α-LA)是一種很強的抗氧化劑,具有容易吸收與轉化以及水相、脂相雙重溶解的特性[16-17]。α-LA作為一種常見的抗氧化劑在臨床科研中得到了廣泛的應用,近年的研究表明,α-LA對氧化應激引起的臟器損傷具有保護作用[18-20],但α-LA能否通過調節(jié)MAPK信號通路緩解Cd誘導的腎臟細胞損傷還不明確。因此,本研究通過SD大鼠體內試驗結合細胞體外試驗進一步驗證α-LA在Cd致大鼠腎細胞損傷中的作用并探究其對MAPK通路的影響,以期為α-LA的臨床應用和Cd中毒的防治提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑紫外分光光度測定儀(上海光譜儀器有限公司);高速勻漿機(PT-MR2100 型,瑞士);熒光顯微鏡(DM2500 Leica)、酶標儀(Tecan,Australia);超凈臺(上海新苗有限公司);PS-9000705 超純水裝置(美國LABCONCO公司);超聲波細胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);臺式高速冷凍離心機5810R(Eppendorf,Germany);SD大鼠購自江蘇大學比較醫(yī)學中心;NRK-52E細胞購于上海細胞庫;α-LA購于Santa公司;醋酸鎘購于 Sigma 公司;RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑購自北京普利萊公司;BCA試劑盒購于碧云天公司;β-actin和MAPK通路相關抗體均購于美國 Cell Signaling Technology公司。

1.2 動物試驗設計24只60～70 g清潔級雌性SD大鼠購回后適應環(huán)境1周,然后稱量體質量并隨機分成4組,每組6只,分別為Control組、Cd組(50 mg/L CdAc2)、Cd+α-LA組(50 mg/L CdAc2+50 mg/kg α-LA)以及α-LA組(50 mg/kg α-LA)。Control組以及α-LA組的大鼠,自由飲用ddH2O;Cd組與Cd+α-LA組的大鼠,自由飲用配制好的Cd液并且每天按時灌胃α-LA;為了減小誤差其他組的大鼠同樣給予ddH2O灌胃處理。持續(xù)處理12周。期間記錄好大鼠每天的體質量以及飲水量和采食量,動物飼養(yǎng)環(huán)境保持清潔干燥,同時溫度控制在最適溫度的范圍內。在試驗結束的第2天用戊巴比妥鈉麻醉后用頸椎脫臼處死并開展相關的試驗進行檢測。

1.3 取材與細胞培養(yǎng)原代細胞的獲取與培養(yǎng):按照動物福利要求將大鼠處死,無菌操作打開腹腔,暴露腎臟并取出,用手術鑷剔除腎臟外的包膜,切下腎皮質于小燒杯中剪碎并研磨,用80目篩網過濾后,1 200 r/min離心5 min。 加入膠原酶于37℃水浴中消化15 min,再次1 200 r/min離心5 min。小心的倒去上清,加入DMEM-F12培養(yǎng)基吹打均勻后以正常培養(yǎng)體積的1/2接種于細胞培養(yǎng)板中,放置在37℃、5% CO2飽和濕度下的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后補充培養(yǎng)基至正常量,繼續(xù)培養(yǎng)至72 h時更換培養(yǎng)基,當細胞長到對數生長期時進行Cd暴露等處理。NRK-52E的細胞培養(yǎng):將NRK-52E細胞培養(yǎng)在含有10%的胎牛血清和100 U/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當細胞鋪滿細胞培養(yǎng)瓶底部時,用0.25%的胰蛋白酶消化細胞1 min,并用含血清的培養(yǎng)基終止胰酶消化,然后用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞并按照1∶3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng),當細胞長到對數生長期時進行Cd暴露等處理。Cd暴露前30 min在細胞培養(yǎng)基中先加入α-LA,然后加入Cd孵育12 h,其中 NRK-52E細胞的Cd濃度為5 μmol/L,rPT細胞的Cd濃度為2.5 μmol/L,α-LA的濃度為200 μmol/L。

1.4 組織學觀察(1)光鏡觀察:切取合適的左腎切片固定于10%福爾馬林溶液,常規(guī)脫水、石蠟包埋切片,HE染色后在光鏡下觀察;(2)電鏡觀察:處死后迅速分離包膜,取右腎皮質切成約1 mm3小塊,于2.5%戊二醛固定液中固定2 h,用磷酸緩沖液漂洗,梯度乙醇以及丙酮脫水,環(huán)氧樹脂包埋,制作超薄切片,用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色,透射電鏡下觀察。

1.5 Western blot檢測MAPK通路相關蛋白的表達常規(guī)方法提取腎皮質組織蛋白或細胞蛋白,取等量的各組織蛋白樣品進行SDS-PAGE后,將凝膠上的蛋白轉印至PVDF膜,用5%的脫脂奶粉(TBST配置)對膜進行常溫封閉90 min,然后加入1∶1 000稀釋的單克隆抗體,4℃孵育過夜;用TBST洗膜6次,每次5 min;洗完后加入HRP標記的二抗(1∶5 000稀釋),常溫孵育2 h;再用TBST洗膜6次,每次5 min;之后進行顯影并用Image Lab軟件測定蛋白條帶的灰度值后進行統(tǒng)計學分析。

1.6 統(tǒng)計學處理試驗數據用先用Excel進行初步處理,然后用SPASS 22.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,并進行多重比較。統(tǒng)計結果以“平均值±標準差”表示,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 Cd脅迫下α-LA對大鼠腎臟超微結構的影響透射電鏡觀察可見,Control組細胞核的核膜完整、核仁清晰、核染色質分布均勻(圖1A)。與Control組比較,Cd組多數細胞核固縮、變形、染色質邊聚甚至溶解,細胞內出現大量空泡(圖1B)。Cd+α-LA組的大鼠細胞核輕微皺縮,染色質分布相對均勻,且向核膜邊緣聚集程度有所緩解(圖1C)。α-LA組細胞核除了輕微的皺縮以及染色質輕微的邊聚外無明顯可見的病理變化(圖1D)。

A.Control組;B.Cd組;C.Cd+α-LA組;D.α-LA組

2.2 Cd脅迫下α-LA對大鼠腎臟組織結構的影響Control組中大鼠的腎皮質無明顯的病理變化,小管間質區(qū)結構清楚,未見炎癥細胞浸潤、纖維組織增生與腎小球硬化(圖2A);Cd組大鼠的腎小球內細胞數量增多,腎小管上皮細胞表現出明顯的變性和壞死,壞死脫落的上皮細胞進入官腔出現大量的管型現象,有的管壁變薄甚至破裂(圖2B);Cd+α-LA組大鼠切片可見腎小球毛細血管有輕微的充血現象,腎小球內細胞數量較少,腎小管管型數量與Cd組比明顯變少(圖2C);α-LA組中無論腎小管還是腎小球都沒有明顯的病理現象(圖2D)。

A.Control組;B.Cd組;C.Cd+α-LA組;D.α-LA組

2.3 Cd脅迫下α-LA對大鼠腎臟組織細胞MAPK信號通路的影響常規(guī)方法提取大鼠腎臟組織蛋白,用Western blot檢測了MAPK信號通路相關蛋白的磷酸化水平,結果如圖3所示,與Control組相比,Cd暴露組大鼠腎組織中ERK1/2和JNK1/2的磷酸化水平極顯著升高(P<0.01),p38的磷酸化水平顯著升高(P<0.05);Cd+α-LA組與Cd暴露組相比,ERK1/2的磷酸化水平極顯著降低(P<0.01),JNK1/2和p38的磷酸化水平顯著降低(P<0.05),但都高于Control組;α-LA組與Control組相比,ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化水平無顯著差異。

2.3 Cd脅迫下α-LA對大鼠腎小管上皮細胞ERK1/2蛋白磷酸化水平的影響結果如圖4所示,與Control組相比,Cd暴露后無論是NRK-52E還是rPT細胞的ERK1/2磷酸化水平都極顯著升高(P<0.01);Cd+α-LA組與Cd暴露組相比,NRK-52E細胞的ERK1/2磷酸化水平顯著降低(P<0.05),rPT細胞的ERK1/2磷酸化水平極顯著降低(P<0.01);α-LA組與Control組相比無論是NRK-52E還是rPT細胞的ERK1/2磷酸化水平都無顯著差異。

A.NRK-52E細胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平;B.rPT細胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平

2.4 Cd脅迫下α-LA對大鼠腎小管上皮細胞JNK1/2蛋白磷酸化水平的影響結果如圖5所示,與Control組相比,Cd暴露后無論是NRK-52E還是rPT細胞的JNK1/2磷酸化水平都極顯著升高(P<0.01);Cd+α-LA組與Cd暴露組相比,NRK-52E細胞的JNK1/2磷酸化水平顯著降低(P<0.05),rPT細胞的JNK1/2磷酸化水平極顯著降低(P<0.01);α-LA組與Control組相比無論是NRK-52E還是rPT細胞的JNK1/2磷酸化水平都無顯著差異。

A.NRK-52E細胞JNK1/2蛋白的磷酸化水平;B.rPT細胞JNK1/2蛋白的磷酸化水平

2.5 Cd脅迫下α-LA對大鼠腎小管上皮細胞p38蛋白磷酸化水平的影響結果如圖6所示,與Control組相比,Cd暴露后無論是NRK-52E還是rPT細胞p38的磷酸化水平都極顯著升高(P<0.01)。Cd+α-LA組與Cd暴露組相比,NRK-52E細胞的p38磷酸化水平極顯著降低(P<0.01),rPT細胞的p38磷酸化水平顯著降低(P<0.05)。α-LA組與Control組相比無論是NRK-52E還是rPT細胞的p38磷酸化水平都無顯著差異。

A.NRK-52E細胞p38蛋白的磷酸化水平;B.rPT細胞p38蛋白的磷酸化水平

3 討論

當受到各種有害刺激時,機體內的氧化與抗氧化之間的平衡被打破,導致活性氧含量升高,從而引起組織細胞損傷,這一現象稱為氧化應激。氧化應激是自由基在體內產生的一種負面作用,在一些疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[21]。Cd作為一種廣泛存在于自然界中的蓄積性毒物,當在動物機體內達到一定量時會造成多個組織器官的損傷,其中對腎臟的損傷尤為明顯[22-23]。α-LA是一種有“萬能抗氧化劑”稱號的強抗氧化劑和自由基清除劑,在體內吸收進入細胞后可還原成二氫硫辛酸并釋放到細胞外,可以消除大部分位置的自由基[18]。α-LA作為巰基供給體很容易與許多毒性物質特別是重金屬離子直接反應,是機體抵御有毒物質的第一條防線,這些特點在所有抗氧化劑中是獨一無二的,是已知天然抗氧化劑中效果最強的一種[24],近十幾年來α-LA的藥理特性備受關注。據文獻報道以及本課題組前期的研究表明發(fā)生氧化應激是Cd致腎臟損傷的重要機制[25-27],當機體的抗氧化能力降低時,Cd引起的氧化損傷就會表現出來。因此,本研究選擇抗氧化劑α-LA作為干預Cd毒性的藥物進行研究,以期為α-LA的臨床應用和Cd毒性的機制提供一定的理論基礎。

MAPK激酶是廣泛存在于真核細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,MAPKs信號轉導途徑具有十分重要的作用,能夠通過磷酸化靶蛋白激活級聯(lián)反應從而參與細胞的增殖、生長、遷移和凋亡等重大生命活動[28-29]。當細胞受到外界不同的刺激后會激活不一樣的 MAPK 信號通路進而使細胞產生不同的功能。據文獻報道,JNK1/2和p38 MAPK的激活可以促使細胞凋亡,而ERK1/2的激活則會抑制細胞凋亡[30-31],本課題組前期在Cd暴露致大鼠腎小管細胞的毒性研究中也證實了這一點[32]。但是α-LA能否在Cd致大鼠腎細胞毒性損傷中通過調控MAPK信號通路發(fā)揮保護作用還不明確。因此,本研究通過體內和體外試驗,重點圍繞MAPK信號通路活化水平的檢測進一步闡明α-LA在Cd致大鼠腎細胞毒性損傷中作用。

本研究中腎臟細胞超微結構和病理組織HE染色結果表明(圖1,2),Cd暴露導致了大鼠腎臟組織的損傷,而α-LA的干預可以明顯緩解Cd暴露所致的這種損傷,結合前期的研究其機制,推測很可能和α-LA發(fā)揮了抗氧化的能力有關。另外,Western blot的檢測結果顯示(圖3～6),無論是體內還是體外Cd暴露時ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化水平顯著升高,α-LA干預后ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化水平顯著降低,但仍然高于Control組,表明Cd暴露激活了MAPK信號通路而α-LA干預在一定程度上可以抑制MAPK的激活。因為前期的研究已經表明Cd暴露導致大鼠腎小管上皮細胞中JNK1/2和p38 MAPK的激活上調了Cd誘導的細胞凋亡率,而ERK1/2 MAPK的激活則下調了Cd誘導的細胞凋亡率,細胞最終的凋亡情況取決于各條通路綜合作用的結果。本研究中α-LA干預明顯緩解Cd暴露所致的大鼠腎細胞損傷,在一定程度上說明α-LA對JNK1/2和p38 MAPK的綜合抑制效果很可能強于對ERK1/2 MAPK的抑制。

綜上所述,α-LA干預能夠抑制Cd誘導的MAPK 信號通路激活,緩解Cd暴露導致的大鼠腎細胞損傷。本研究對進一步揭示Cd致腎毒性的機制具有一定的意義,也為臨床α-LA 的應用擴展提供了試驗依據。