甜菜堿對TGF-β1誘導的小鼠乳腺上皮細胞纖維化模型的影響及其機制

徐平,闞興池,黃雅萍,劉憶瑤,李宇航,付守鵬,柳巨雄

(吉林大學 動物醫學學院,吉林 長春 130062)

奶牛乳腺纖維化是一種以乳腺肌成纖維細胞聚集和細胞外基質(extracellular matrix,ECM)過度沉積為特征的疾病,通常由久治不愈的乳腺炎遷延所致。該病理過程導致產奶量及乳品質下降,嚴重時可發展為乳腺硬化增加奶牛淘汰率,給奶牛業造成了嚴重的經濟損失。

纖維化是一種慢性損傷后修復過程,受損傷的組織或器官過度地形成纖維結締組織,其替代了正常組織結構,侵占了功能性細胞的生存空間。雖然目前奶牛乳腺纖維化的具體發病機制還尚未研究清楚,但有研究報道,上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和成纖維細胞激活是纖維化的兩個重要病理過程,這種兩種過程均產生大量的ECM[1-2]。其中EMT是上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的過程。在EMT過程中上皮細胞極性丟失并具備了成纖維細胞的特性,如細胞的遷移能力和分泌ECM的能力顯著增強并且伴有大量的趨化因子分泌,導致ECM沉積[1],進而加劇纖維化進程。

此外,有研究表明纖維化的發生發展和炎癥密切相關。炎癥往往是纖維化的啟動因素和驅動力,在纖維化病變過程中往往伴有持續的炎癥環境,而炎癥環境進一步激活成纖維細胞活化和EMT過程,加劇ECM的進一步積累最終導致纖維化的發生[3]。因此緩解炎癥反應和有效阻止上皮細胞EMT進程是有效緩解纖維化病變的潛在治療途徑。但是目前關于奶牛乳腺纖維化的研究相對較少,仍需進一步深入研究。

近年來中藥單體用于預防或阻止纖維化進程是一個具有廣闊應用前景的研究方向,為纖維化的防治提供了新的思路。甜菜堿(betaine,BT)可從天然植物的根、莖、葉及果實中提取,甜菜的糖蜜是BT的主要來源,其具有良好的抗炎、殺菌、抗腫瘤等藥理作用[4-5]。但到目前為止國內外關于BT用于乳腺纖維化治療的研究尚未見報道。因此本研究探究了BT對由TGF-β1誘導的mMECs纖維化細胞模型的影響及其機制,以期為奶牛乳腺纖維化的防治提供試驗數據和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料BT購買自南京道斯夫技術有限公司,HPLC≥98%;TGF-β1購買于Proteintech公司;TRIzol試劑購買于Invitrogen公司;DMEM粉末培養基購買于Hyclone公司;BCA蛋白測定試劑盒購買于碧云天試劑公司;CCK8試劑購買于北京索萊寶公司; NF-κBp65、P38、ERK、phospho-NF-κBp65、phospho-P38、phospho-ERK、Smad和β-actin抗體購買于Cell Signaling Technology公司;TGF-β1抗體購買于Proteintech公司;COL 1和p-Smad抗體購買于Abcam公司。

1.2 CCK8試驗在96孔板中均勻接種細胞,當細胞生長至底壁面積的70%時,用BT和TGF-β1處理細胞48 h。48 h后每孔加入10 μL的CCK8,在37℃細胞培養箱中繼續放置1 h,然后將96孔板放置在酶標儀內,檢測細胞450 nm處的吸光度,并進行數據分析。

1.3 熒光定量試驗將TRIzol試劑加入培養皿中,在室溫下裂解細胞。 提取總RNA并進行逆轉錄反應。 在8連排管中,分別加入8 μL的cDNA、10 μL 的2×SYBR Premix和各1 μL的上下游引物,搖勻后進行PCR。 β-actin作為對照,通過2-ΔΔCt方法確定目標mRNA的相對表達量,檢測BT對mMECs細胞產生炎性細胞因子的影響。引物信息見表1。

表1 引物序列

1.4 Western blot試驗利用細胞裂解液從細胞中收集蛋白質,使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度,將蛋白轉移到4% SDS-PAGE凝膠中電泳75 min。通過半干法將蛋白轉移到PVDF膜。用5%脫脂牛奶溶液密封膜2 h。加入一抗(1∶1 000),4℃孵育過夜,洗滌5次,加入山羊抗兔(1∶8 000)或山羊抗小鼠(1∶8 000)二抗,室溫孵育1 h,洗滌5次,采用化學發光試劑盒檢測蛋白條帶。

1.5 數據統計使用軟件GraphPad Prism 8對數據進行分析,數據以平均值±標準差表示,組間差異采用單因素方差分析(one way-ANOVA)進行統計學分析。P<0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 BT或TGF-β1對mMECs存活率的影響如圖1所示,1 mol/L以內的BT對mMECs的存活率沒有影響,5 mol/L BT對細胞表現出細胞毒性作用。5 μg/L TGF-β1對mMECs的存活率沒有影響,因此試驗采用1 mol/L BT開展以下研究。

*表示與空白對照組相比P<0.05,**表示與空白對照組相比P< 0.01;#表示與TGF-β1模型組相比P<0.05,##表示與TGF-β1模型組相比P<0.01。下同

2.2 BT對TGF-β1誘導的mMECs中炎性細胞因子的影響炎性細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的過度表達和分泌可以加劇炎癥反應的嚴重程度進而導致纖維化,因此對炎性細胞因子的mRNA水平進行檢測。試驗結果表明,TGF-β1組炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA水平顯著升高,而BT預處理顯著降低IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA水平(圖2)。結果表明BT能夠減少TGF-β1誘導的mMECs的EMT過程中炎性細胞因子的表達。

A.mMECs中IL-1β基因表達情況;B.mMECs中IL-6基因表達情況;C.mMECs中TNF-α基因表達情況

2.3 BT對TGF-β1誘導的mMEC中COL 1、α-SMA蛋白表達水平的影響COL 1、α-SMA蛋白是重要的纖維化表型指標,因此對COL 1、α-SMA蛋白進行了檢測。結果顯示,與正常組相比,TGF-β1組中COL 1、α-SMA蛋白表達水平顯著升高,但BT干預后COL 1、α-SMA蛋白表達水平顯著降低(圖3)。這一研究結果表明BT通過抑制COL 1、α-SMA蛋白水平的升高,有效緩解mMECs的EMT進程,減少ECM的積累。

A.mMECs中COL 1,α-SMA的蛋白水平;B.mMECs中COL 1蛋白的相對密度值分析;C.mMECs中α-SMA蛋白的相對密度值分析

2.4 BT對TGF-β1誘導的mMECs中NF-κB信號通路的影響有研究表明,NF-κB信號通路在細胞炎癥過程中具有重要作用。為了研究BT抑制炎癥反應的機制,利用Western blot技術檢測NF-κB信號通路,結果表明TGF-β1處理導致NF-κBp65,IκBα的磷酸化水平顯著升高,而BT能夠顯著降低NF-κBp65,IκBα磷酸化水平的升高(圖4A,B,C),此外,利用分子對接技術對BT和p65的相互作用進行模擬,發現BT和p65蛋白的結合能為-14.6 kJ/mol,并且BT和p65蛋白的氨基酸殘基ASN-155具有氫鍵相互作用,推測其可能是BT和p65相互作用的活性位點(圖4D)。上述結果表明BT和p65具有很強的結合作用,進一步驗證了BT在NF-κB活化中的作用。

A.mMECs中p-NF-κB p65,p-IκBα蛋白水平;B.mMECs中p-NF-κB p65蛋白的相對密度值分析;C.mMECs中p-IκBα蛋白的相對密度值分析;D.采用AutoDock 4模擬p65與BT的分子對接

2.5 BT對mMECs中TGF/Smad信號通路的影響TGF/Smad通路在纖維化的發生發展中發揮重要的作用。因此,利用Western blot技術檢測TGF/Smad通路,發現BT能夠顯著降低TGF-β1誘導的TGF/Smad信號通路的激活(圖5A,B,C)。 此外,利用分子對接技術對BT和Smad蛋白的結合進行預測,發現BT和Smad蛋白的結合能為-17.5 kJ/mol,并且BT和Smad蛋白的氨基酸殘基ARG-219和ASP-309具有氫鍵相互作用,推測其可能是BT和Smad相互作用的活性位點(圖5 D)。上述結果證實BT和Smad具有很強的結合作用,進一步驗證了BT在TGF/Smad信號通路的作用。

A.mMECs細胞中p-Smad,TGF蛋白相對表達水平; B.mMECs細胞中p-Smad蛋白的相對密度值分析;C.mMECs細胞中TGF蛋白的相對密度值分析;D.采用AutoDock 4模擬p65與Smad的相互作用

3 討論

奶牛乳腺纖維化通常由久治不愈的乳腺炎遷延所致,該病理過程使產奶量及乳品質下降,嚴重時可發展為乳腺硬化增加奶牛淘汰率,給奶牛業造成嚴重的經濟損失。目前尚缺乏效果明顯的預防和緩解藥物,因此尋找預防奶牛乳腺纖維化的新治療藥物顯得十分必要。在本研究中,以TGF-β1刺激mMECs為細胞纖維化模型,發現BT能夠通過抑制NF-κB和TGF/Smad信號通路緩解纖維化。

炎癥常常伴隨著纖維化的發生發展,當炎癥發生時,會產生大量的炎性細胞因子,例如IL-1β、TNF-α和IL-6等, 并引發聯級反應[6], 成纖維細胞和上皮細胞啟動異常修復模式,導致ECM沉積并最終形成不可逆纖維化[7]。有研究表明持續的炎癥刺激是纖維化非常重要的原因和纖維化的前置狀態,因此,抑制IL-1β、TNF-α和IL-6的分泌是減少ECM積累的有效途徑[8]。本研究在TGF-β1誘導的mMECs纖維化模型中發現,BT顯著抑制炎性細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達,因此,BT可以有效消除或減輕TGF-β1對mMECs的持續炎癥刺激,繼而對后續纖維化產生抑制作用。

盡管乳腺纖維化的發病機制尚不完全清楚,但ECM過度沉積對促進纖維化發生已有大量研究報道。collagen蛋白是ECM的主要代表成分,HAMEED等[9]研究表明抑制collagen 1蛋白水平的升高可以有效地緩解肝臟纖維化的發展。此外,EMT過程在纖維化的發生發展中也起著關鍵作用,EMT期間上皮細胞具備成纖維細胞特點,其遷移能力和分泌能力顯著增強,上皮細胞黏蛋白減少,α-SMA表達增加,促使ECM大量產生[4]。LU等[10]研究發現通過抑制α-SMA的表達可緩解腎臟纖維化的發展。本研究采用Western blot技術檢測纖維化相關COL 1和α-SMA蛋白的表達。結果表明,與TGF-β1組比較,經過BT干預后mMECs中COL 1、α-SMA蛋白的表達水平顯著降低,以上結果表明BT對TGF-β1誘導的細胞纖維化模型具有抑制作用,有效緩解mMECs的EMT進程,減少ECM的積累。

為了探究BT抑制TGF-β1誘導的mMECs炎癥反應的潛在機制,本研究檢測了NF-κB信號的激活情況。有報道指出天然產物往往具有抑制纖維化過程中NF-κB信號激活的作用, 如竹節參皂苷通過抑制NF-κB介導的炎癥反應的發生有效地緩解腎纖維化[11]。因此,BT可能會通過類似的方式來發揮對纖維化的治療作用。在許多炎癥反應中,NF-κB信號通路通過促進炎癥因子的轉錄調控炎癥反應,被認為是減輕炎癥的潛在靶點。正常情況下,NF-κBp65存在于細胞質中與IκBα結合緊密,但在受到外界刺激后,IκBα被激活降解和磷酸化,導致NF-κBp65磷酸化,隨后NF-κBp65經歷核轉位并發揮轉錄作用[12]。本研究發現TGF-β1誘導mMECs中NF-κBp65和 IκBα的磷酸化,而BT能夠顯著抑制NF-κBp65和IκBα的磷酸化。以上試驗結果表明,在TGF誘導的mMECs纖維化的過程中,BT通過抑制NF-κBp65信號通路來抑制炎癥反應的發生。

TGF-β1是一種多功能細胞因子,在細胞的增殖分化、創傷 修復、免疫反應和炎癥反應等過程中具有重要的調節作用[13]。越來越多的證據表明,TGF-β1/Smad信號通路的異常激活是導致纖維化的主要原因[14-16]。在肝臟纖維化的研究中顯示,TGF-β1與肝損傷、肝細胞凋亡密切相關, 也是誘導肝纖維化發生的重要原因之一[14]。LANG等[17]發現 TGF-β1 siRNA可顯著下調TGF-β1的表達,抑制肝星狀細胞的增殖,減少CoL-I和CoL-Ⅲ的產生,從而改善大鼠肝纖維化的發展。因此,抑制TGF-β1的表達和分泌是緩解纖維化病理過程的有效途徑[18]。Smad蛋白是目前已知的TGF-β1受體細胞內激酶最重要的底物[19]。TGF/Smad是促進纖維化發生發展的重要信號通路,SHEN等[20]發現,在心肌纖維化過程中TGF/Smad信號被異常激活,而抑制TGF/Smad信號通路的激活能夠緩解纖維化的發生,目前開發TGF/Smad信號的有效抑制劑是緩解纖維化疾病的重要研究方向。本研究發現BT顯著抑制TGF/Smad信號通路的激活。本研究的結果表明,BT通過抑制TGF/Smad信號通路,從而抑制TGF-β1誘導的mMECs纖維化的發生。

綜上所述,本研究得出以下結論,BT對TGF-β1誘導的mMECs纖維化細胞模型具有緩解作用,其作用機制是BT一方面抑制NF-κB信號的激活,抑制炎癥反應,間接緩解EMT進程;另一方面直接抑制TGF/Smad信號通路的激活減輕纖維化表型指標的升高,進而減少ECM沉積。因此,BT有望成為防治奶牛乳腺纖維化的潛在藥物。