氯胺酮通過抑制谷氨酸受體和蛋白激酶損害孕鼠子代的學習記憶能力

趙菁華,姜 勝,張儒新,李沫萱,楊 玙,秦 潛,高 利,曾 歡*,王 巍*,宋厚輝*

(1.浙江農林大學 動物科技學院/動物醫學院 浙江省畜禽綠色生態健康養殖應用技術研究重點實驗室/動物健康互聯網檢測技術浙江省工程研究中心,浙江 杭州 311300;2.東北農業大學 動物醫學學院,黑龍江 哈爾濱 150030)

學習和記憶是大腦的高級功能,麻醉藥物的使用是否會影響學習和記憶能力已引起越來越多的關注[1-2]。有關報道表明有些全身麻醉患者可能出現認知功能障礙[3]。幾乎2%的孕婦因各種原因需要手術治療,產前因素是影響后代智力發育的主要因素[4-5]。近年來,在嚙齒類動物和靈長類動物進行的大量試驗表明,臨床中常用的麻醉劑(如氯胺酮)會導致大腦發育障礙、神經毒性和長期認知功能障礙[6-7]。常用的麻醉劑大多是脂溶性的,容易通過血腦屏障,進入胎兒血液循環和腦組織。因此,麻醉藥是否會損害胎兒的大腦發育尤其值得關注[8-9]。研究表明,海馬體是氯胺酮損傷的主要部位,而且海馬的CA1和CA3區域被認為與空間學習和記憶能力密切相關[10]。麻醉劑量的氯胺酮會導致認知能力的改變,然而潛在的機制仍不清楚。

谷氨酸受體在大腦皮層和海馬中高度表達,并在神經發育、學習記憶、感覺和突觸可塑性中發揮核心作用。因此,神經元中谷氨酸受體的調節對于突觸傳遞非常重要[11]。蛋白激酶(CaMKⅡ、PKA、PKC)對突觸可塑性也發揮重要調節作用,大量研究報道神經元細胞中蛋白激酶的激活參與離子通道、受體脫敏、神經遞質釋放和突觸傳遞的調節,這個過程是長時程增強(LTP)形成的分子機制之一[12-13]。本研究通過建立孕鼠氯胺酮暴露模型,探究氯胺酮對子代幼鼠行為學、軸突數目、尼氏小體和樹突棘密度的影響,檢測海馬中谷氨酸受體和相關蛋白激酶的表達,研究結果將為獸醫臨床麻醉藥物的使用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物將體質量(230±20) g的雄性和雌性Wistar大鼠置于溫度和濕度適宜的環境中,自由采食飲水,并進行12 h的光照/黑暗循環。所有動物的試驗程序均按照浙江農林大學實驗動物倫理委員會規范進行。

1.2 主要試劑氯胺酮(購自沈陽市獸藥廠);RIPA裂解液、PMSF、蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒、尼氏染液等購自碧云天生物技術有限公司;蛋白Marker購自上海天能科技有限公司;GAPDH、CaMKⅡ、PKA、PKC、GluR1、GluR2、GluN1、GluN2A和GluN2B單克隆抗體購自美國CST;IgG-HRP抗體購自上海優寧維生物科技股份有限公司;脫脂奶粉購自完達山乳品有限公司;高爾基染液購自合肥萬物生物;反轉錄試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司;試驗中使用的引物都由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 主要儀器水迷宮試驗系統購自上海然哲儀器廠;超凈工作臺購自上海燈晟儀器廠;-80℃冰箱購自青島海爾集團;EPS 300電泳儀購自上海天能科技有限公司;SX-500高壓滅菌鍋購自上海天美科技有限公司;液氮罐購自美國Thermo Scientific公司;倒置顯微鏡購自日本Nikon;梯度PCR儀購自日本TaKaRa Bio株式會社。

1.4 麻醉及樣品采集將30只Wistar大鼠分成10個籠子(每個籠子1只雄鼠和2只雌鼠),底部放置1個鐵網。第2天如果檢測到雌鼠陰道內有陰道栓子,則認為該鼠已懷孕,標記為妊娠第0天,并將孕鼠隔離飼養。妊娠第14天,將20只孕鼠隨機分為對照組(C組,n=10)和氯胺酮組(K組,n=10)。氯胺酮組孕鼠首先肌肉注射氯胺酮(80 mg/kg),每隔1 h按照40 mg/kg補藥3次,對照組孕鼠同樣時間注射相同體積的生理鹽水。在子代出生后第25～29天,連續5 d分別取對照組和氯胺酮組子代幼鼠進行Morris水迷宮試驗。行為學試驗結束后,將子代幼鼠斷頸處死,分離出海馬體,1/2放入液氮凍存,其余組織固定在10%福爾馬林溶液中。

1.5 Morris水迷宮試驗在直徑為120 cm、高50 cm 的圓形水箱中裝滿35 cm深的水,并保持(24±1)℃的溫度。迷宮被分成4個大小相等的象限:SW、SE、NE和NW。在其中1個象限中,逃生平臺被淹沒在水面以下1.5 cm處。在出生后第25～29天,子代幼鼠連續5 d接受測試,每日4次(測試間隔60～70 min)。將每只大鼠依次放入4個象限中,最多允許60 s定位平臺。如果大鼠在60 s 內沒有到達平臺,則將它們引導到平臺,然后讓它們在那里停留10 s。所有測試都進行錄像,并通過視頻跟蹤系統記錄60 s內大鼠游泳路徑軌跡以及進入平臺象限區域的次數。

1.6 透射電鏡觀察將子代幼鼠海馬切成小于1 mm3的組織塊,用2.5%戊二醛磷酸緩沖液固定2 h;將0.2 mol/L磷酸緩沖液與雙蒸水等量混合配成沖洗液,沖洗組織塊2次,每次間隔15 min。先后采用酒精和丙酮進行脫水,包埋后將組織塊修成塔形,用超薄切片機切成超薄切片,再置于銅網上。用枸櫞酸鉛染色液對切片進行染色,最后,將載有超薄切片的銅網置于透射電鏡內進行觀察和拍攝。將照片輸入形態學圖像分析系統中,對照片中的軸突進行識別計數。

1.7 尼氏小體染色將固定好的海馬體先制作成組織切片,使用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ進行脫蠟,然后使用100%,95%,90%,80%,70%,50%的酒精進行梯度濃度脫水,每次浸泡5 min,接著使用蒸餾水對組織切片進行3次沖洗,每次5 min。沖洗后使用1%甲苯胺藍染色40 min,最后使用蒸餾水將切片上殘余的染液清洗干凈,再置于不同濃度的酒精中進行脫水,最后經過二甲苯透明后,使用中性樹膠封片。

1.8 高爾基染色通過高爾基染色可以顯示神經元和膠質細胞樹突棘的形態變化。將子代幼鼠的海馬體切成5 mm厚的小塊,浸泡在1.5%的硝酸鹽水溶液中鍍銀,避光儲存3 d,每天都使用新的鍍銀液體,目的是使鍍銀更加充分。使用火棉膠包埋組織塊,使用切片機切片,將切片置于2%的重鉻酸鉀水溶液中進行漂洗,漂洗時間為10～15 min,當天可以放1張蓋玻片,在顯微鏡下直接觀察。

1.9 RT-PCR本試驗所用引物序列詳見表1。對海馬體中的總RNA進行提取:將海馬體放入1 mL 的TRIzol裂解液中進行研磨,經過兩相分離后,得到的上層透明液體即為提取的RNA。上清中加入等體積的異丙醇,混合后進行離心,經過清洗和干燥后,使用移液槍反復吹打將RNA完全溶解。使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。RT-PCR反應結束后,應用2-ΔΔCt計算RT-PCR數據。

表1 引物相關信息

1.10 Western blot首先取0.1 g的海馬組織加入裂解液,然后進行研磨,所有操作都要在液氮里進行。將取出的樣品裂解完全后進行離心,取上清進行蛋白含量的測定,加入染液進行定量測定。配制分離膠和濃縮膠,上層膠的電泳條件為80 V、25 min,下層膠的電泳條件為120 V、70 min左右。使用200 mA電流進行轉膜,封閉結束后孵育一抗,抗體分別為GAPDH、CaMKⅡ、PKA、PKC、GluR1、GluR2、GluN1、GluN2A和GluN2B。使用二抗進行孵育后進行洗滌曝光,最后使用Image J軟件對蛋白條帶進行分析。

1.11 數據處理使用GraphPad Prism 7.0軟件進行數據統計和分析,對數據進行正態分析和方差齊性檢驗后,使用獨立樣本t檢驗分析對照組和氯胺酮組的數據。P<0.05為兩組數據之間存在顯著性差異。

2 結果

2.1 氯胺酮麻醉對子代幼鼠學習記憶的影響在Morris水迷宮試驗中,每次試驗60 s內小鼠尋找到平臺所用的時間即為逃逸潛伏期測定值。結果顯示,在測試第2～4天,對照組和氯胺酮組子代幼鼠的逃逸潛伏期存在顯著性差異(P<0.01)。而且隨著測試天數的增加,兩組大鼠的逃避潛伏期測定值逐漸降低(圖1A)。同時比較了60 s內兩組大鼠跨越平臺次數,結果發現氯胺酮組大鼠的次數比對照組降低,但兩組之間沒有顯著性差異(圖1B)。對照組大鼠尋找平臺的運動軌跡比氯胺酮組更密集,活動范圍幾乎覆蓋整個水池內(圖1C,D)。檢測結果說明氯胺酮麻醉會損傷子代幼鼠在空間方面的學習記憶能力。

A.定位導航試驗60 s內找到平臺的時間;B.子代幼鼠穿過平臺區域的次數;C～D.大鼠在空間探索試驗中的運動軌跡。與對照組比較,*示P<0.05,**示P<0.01。下同

2.2 氯胺酮麻醉對子代幼鼠神經元軸突數量的影響使用透射電子顯微鏡觀察了子代幼鼠海馬CA1和CA3區軸突數目,圖片中可以看到大量有髓鞘包繞的軸突終末(Ax),每個軸突終末內均含有大量的突觸小泡和線粒體。從圖片分析結果可以看出,在CA1和CA3區,對照組的軸突終末數目顯著高于氯胺酮組,軸突分布緊密,并和臨近的樹突形成突觸連接,氯胺酮組軸突終末分布的比較稀疏(圖2A～D)。每張片子隨機選擇5個不同區域進行軸突數目計數,發現氯胺酮麻醉導致子代幼鼠CA1和CA3區軸突數目顯著降低(P<0.01)(圖2E)。

A.對照組海馬體CA1區軸突(Ax)形態;B.氯胺酮組海馬體CA1區軸突形態;C.對照組海馬體CA3區軸突形態;D.氯胺酮組海馬體CA3區軸突形態;E.兩組大鼠單位面積內軸突數目統計學結果

2.3 氯胺酮麻醉對子代幼鼠神經元尼氏小體的影響尼氏小體是分布于神經細胞胞質內的三角形或橢圓形小塊狀物質,能被堿性染料染成藍色。每張切片隨機選擇5個不同的視野進行觀察,結果發現對照組子代幼鼠神經元尼氏小體數量更多,排列更密集,染色更深(圖3C,E)。氯胺酮組的神經元尼氏小體染色明顯變淺,尼氏小體出現溶解或萎縮,邊緣混亂(圖3D,F)。光密度分析結果表明,氯胺酮麻醉后海馬體CA1和CA3區尼氏小體平均光密度相對于對照組顯著降低(P<0.01),與切片染色結果相一致(圖3G)。

A.對照組海馬體尼氏染色整體形態;B.氯胺酮組海馬體尼氏染色整體形態;C,D.兩組大鼠CA1區尼氏小體染色結果;E,F.兩組大鼠CA3區尼氏小體染色結果;G.兩組大鼠單位面積內尼氏小體數目統計學結果

2.4 氯胺酮麻醉對子代幼鼠神經元樹突棘數量的影響高爾基染色可以將神經元上的樹突棘染成黑色,使用光學顯微鏡在油鏡下對海馬CA1和CA3區的樹突棘進行計數,隨機選擇10 μm長度的不同神經元的梢部和基部,計算每組樹突上的棘數量,從而明確氯胺酮麻醉對神經元形態可塑性的影響。結果發現,氯胺酮組樹突棘稀疏(圖4C～D,H～I),無論是CA1或者CA3區,氯胺酮組單位長度上的樹突棘數量相對于對照組都顯著降低(P<0.05)(圖4E,J)。

A～B.對照組CA1區梢部和基部樹突棘形態;C～D.氯胺酮組CA1區梢部和基部樹突棘形態;E.兩組大鼠CA1區單位長度內樹突棘數目統計學結果;F～G.對照組CA3區梢部和基部樹突棘形態;H～I.氯胺酮組CA3區梢部和基部樹突棘形態;J.兩組大鼠CA3區單位長度內樹突棘數目統計學結果

2.5 氯胺酮麻醉對子代幼鼠谷氨酸受體和蛋白激酶基因表達的影響使用RT-PCR方法檢測海馬區離子型谷氨酸受體和蛋白激酶基因的轉錄水平。研究發現,與對照組比較,氯胺酮麻醉組的CaMKⅡ、PKC、GLuN2A和GluR1的基因表達顯著降低(P<0.05),GLuN1和GLuN2B的基因表達存在極顯著性差異(P<0.01),PKA和GluR2的基因表達量雖然降低,但相對于對照組沒有顯著性差異(P>0.05)(圖5)。

A～H.分別為CaMKⅡ、PKA、PKC、GLuN2A、GLuN2B、GLuR1和GLuR2基因的表達水平

2.6 氯胺酮麻醉對子代幼鼠谷氨酸受體和蛋白激酶蛋白表達的影響使用Western blot方法檢測海馬區離子型谷氨酸受體和蛋白激酶的蛋白表達。結果發現,麻醉組的CaMKⅡ(P<0.05)、PKA、PKC、GLuN2A、GLuN2B、GluR1和GluR2的蛋白表達相對于對照組顯著降低(P<0.01),但兩組之間的GLuN1蛋白表達沒有顯著性差異(P>0.05)(圖6)。

A～H.分別為CaMKⅡ、PKA、PKC、GLuN2A、GLuN2B、GLuR1和GLuR2蛋白的表達水平

3 討論

氯胺酮屬于苯環已哌啶類靜脈麻醉藥,對呼吸系統的抑制作用較小,因此廣泛應用于中外獸醫臨床[14]。幾乎所有的麻醉藥都會通過胎盤屏障,之前有研究發現很多麻醉藥都會導致中樞神經系統的神經元發生凋亡,并導致晚年的行為障礙[15]。本研究發現在母鼠懷孕第14天持續注射氯胺酮會導致子代幼鼠學習和記憶功能發生損傷。Morris水迷宮試驗通常用來評估子代幼鼠的空間學習記憶能力,本研究發現氯胺酮組幼鼠需要花費更多的時間才能找到定位平臺,說明子代幼鼠的空間學習記憶功能水平降低。

尼氏小體主要參與神經元蛋白質的合成,在細胞發生損傷時,尼氏小體的形態會發生敏感性變化,因此常用尼氏染色來判斷神經元的狀態[16]。尼氏小體染色常用的染料包括甲酚紫和甲苯胺藍等,可以將尼氏小體染成藍色,藍色顆粒的密度和數量與神經元狀態呈正相關。研究發現奎寧等化學藥物會導致神經元細胞出現空泡變性,尼氏小體大量溶解或消失,進而導致與突觸相關的蛋白質的合成減少[17]。本研究發現,氯胺酮麻醉會導致子代幼鼠神經細胞尼氏小體的數量降低,說明孕鼠持續使用氯胺酮會導致后代的神經元發生損傷,并進一步導致神經生長相關蛋白的合成減少。突觸在神經傳遞中發揮重要作用,軸突和樹突的正常狀態可以保證整個神經系統信號傳遞有規律的進行。本研究中透射電鏡和高爾基染色結果表明,氯胺酮也會使海馬體軸突和樹突棘的數量減少,突觸信息傳遞功能受損,進而導致子代幼鼠學習和記憶功能水平降低。

中樞神經系統的突觸可塑性是機體完成高級功能(如學習和記憶)的基礎,突觸可塑性相關蛋白的合成對于維持神經系統的正常功能非常重要。中樞神經系統中的突觸傳遞主要由谷氨酸介導的興奮性突觸完成,并導致興奮性突觸后電位的出現。NMDA和AMPA型谷氨酸受體是突觸后膜的重要組成部分,因為它們對于突觸傳遞至關重要。研究報告稱,阻斷NMDA受體會降低突觸可塑性并損害兒童突觸前發育的學習和記憶[18]。分布在海馬體中的NMDA受體介導學習和記憶功能,是產生和維持LTP的關鍵部分。在本研究中,我們發現NMDA受體亞基(GLuN1、GLuN2A、GLuN2B)的表達下降,說明氯胺酮抑制了NMDA受體的激活,損傷了突觸,最終導致子代幼鼠學習和記憶能力下降。除此之外,神經系統許多重要功能也需要AMPA受體參與,包括突觸可塑性的維持和記憶的形成[19]。有人提出突觸后蛋白的棕櫚酰化可上調AMPA受體膜的表達并增強突觸功能,從而間接表明AMPA受體對突觸功能的重要性[20]。YANG等[21]報道苯并芘通過阻礙谷氨酸神經遞質的傳遞來降低AMPA受體亞基的表達,從而增加SNAP-25的含量并擴大突觸間隙,最終影響突觸的傳遞。這與本研究結果相似,本研究中氯胺酮麻醉導致AMPA受體亞基(GluR1和GluR2)含量呈不同程度下降,軸突和樹突棘密度也呈不同程度下降,最終削弱了海馬神經元的突觸可塑性。

蛋白激酶在LTP和突觸可塑性中發揮重要作用,它們可以調節突觸的相關功能蛋白,促進新樹突棘的形成,并在激活時影響核轉錄因子和蛋白質翻譯起始因子的磷酸化狀態。因此蛋白激酶在LTP的誘導和維持中起著積極的調節作用[22]。CaMKⅡ是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,在突觸后膜高表達,一項研究表明,CaMKⅡ/NMDAR是維持LTP的重要記憶分子[23]。CaMKⅡ還通過C末端特異性絲氨酸的磷酸化增強谷氨酸AMPA受體的磷酸化,CaMKⅡ還可增強AMPA受體功能,影響突觸可塑性[24]。PKA常見于動物體內,是中樞神經系統的重要信號因子之一。PKA不僅可以調節AMPA受體的轉運,還可以促進軸突的再生,調節突觸前神經遞質的釋放,從而調節突觸活動[25]。在本研究中,PKA和AMPA受體亞基的變化呈相同趨勢,氯胺酮麻醉導致兩者的含量均降低,結合高爾基染色結果表明,PKA通路對維持突觸活性至關重要。大量研究表明PKC與突觸可塑性和LTP的形成密切相關,抑制PKC會減少LTP的形成,從而影響學習和記憶[26]。在目前的研究中,孕鼠注射氯胺酮會導致子代幼鼠記憶相關的蛋白激酶表達顯著降低,這可能是導致突觸可塑性和神經功能異常的關鍵原因。

綜上,對懷孕中期的母鼠進行長時間的氯胺酮麻醉會對子代幼鼠的空間學習和記憶能力造成損傷,并導致軸突和樹突棘的生成減少,使谷氨酸受體亞基和相關蛋白激酶的蛋白合成下降。本研究為獸醫臨床中麻醉藥物的使用提供了理論補充,并為進一步降低麻醉藥物的副作用提供了方向。