羊傳染性膿皰病毒ORF120蛋白以劑量依賴性方式抑制宿主細胞非POU結構域八聚體結合蛋白(NONO)的表達

于昭輝,周艷龍,呂麗君,劉興源,徐夢實,方梓煜,李卓梅,關繼羽,高 豐,趙 魁

(吉林大學 動物醫學學院 人獸共患病研究教育部重點實驗室,吉林 長春 130062)

羊傳染性膿皰病又稱“羊口瘡”,是由痘病毒科、副痘病毒屬的羊傳染性膿皰病毒(Orf virus,ORFV)引起的一種高度接觸性的人獸共患傳染病[1],廣泛分布在世界各養羊地區。盡管ORFV感染能夠誘導機體產生強烈的免疫應答反應,但其仍可重復感染宿主[2]。研究表明,ORFV重復感染的一個重要原因是病毒可利用自身編碼的免疫調節蛋白逃逸宿主的免疫反應,這些免疫調節因子包括ORFV117基因編碼的哺乳動物白介素-10同系物(vIL-10)[3]、ORFV020基因編碼產生的干擾素抗性蛋白(OVIFNR)[4]、ORFV112基因編碼的趨化因子結合蛋白(CBP)[5]、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細胞介素-2(IL-2)抑制因子(GIF)以及病毒血管內皮生長因子-E(VEGF-E)等[6]。此外,ORFV被證實能通過編碼多個NF-κB轉錄調節因子抑制劑(ORFV002、ORFV024、ORFV073、ORFV119、ORFV120和ORFV121),促進病毒在細胞中存活[7]。

非POU結構域八聚體結合蛋白(non-POU-domain-containing octamer binding protein,NONO),也稱為p54(nrb),屬于果蠅行為/人類剪接(DBHS)蛋白家族[8],是一種多功能核蛋白,廣泛存在于大多數哺乳動物細胞核中,尤其是在副核的亞核結構域。大量研究表明,NONO參與mRNA剪接、DNA解鏈、DNA損傷修復、基因轉錄調控等細胞生命活動[9-10],此外,其與多種惡性腫瘤的發生發展、細胞免疫反應等密切相關,包括肝癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、腎細胞癌、黑色素瘤等[11-13]。近期研究發現,宿主蛋白NONO在人類免疫缺陷病毒(HIV-1)[14]、偽狂犬病病毒(PRV)[15]和EB病毒(EBV)[8]等多種病毒感染過程中也發揮重要的調節作用。

本研究從病毒-宿主互作角度,利用酵母雙雜交、Co-IP、激光共聚焦技術等證實NONO蛋白與病毒ORF120蛋白在細胞核中共定位并存在相互作用,并進一步利用Western blot方法證實NONO蛋白與病毒ORF120蛋白表達存在劑量依賴性的相互抑制,為后期深入探討宿主NONO蛋白在ORFV感染過程中的功能研究提供依據,并將為全面解析ORFV致病分子機制以及抗病毒藥物靶標的篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料DMEM購自大連美侖生物;TRIzol試劑購自Invitrogen公司;BCA蛋白測定試劑盒購自碧云天試劑公司;pcDNA3.1-mCherry、pcDNA3.1-His載體購自Invitrogen公司;pCMV-N-FLAG載體購自Clontech公司;蛋白A/G瓊脂糖珠收集抗體結合蛋白購自Thermo Fisher公司;Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 488抗體購自Abcam公司;NONO抗體、His標簽抗體、GAPDH抗體購自Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1細胞和病毒 原代胎羊鼻甲骨(OFTu)細胞由本實驗室分離培養并保存;HeLa細胞由本實驗室保存;野生型病毒OV-SY17由本實驗室分離鑒定并保存;OV-SY17Δ120基因缺失毒株和拯救毒株OV-SY17-RV120由本實驗室構建并保存。

1.2.2基因擴增和質粒構建 用TRIzol提取OV-SY17感染OFTu細胞的總RNA,然后逆轉錄成cDNA。通過PCR擴增病毒ORF120基因和宿主蛋白NONO基因,然后分別連接到載體pGBKT7和載體pGADT7上,構建pGBKT7-ORF120和pGADT7-NONO質粒。將PCR擴增獲得的ORF120基因片段連接至pcDNA3.1-His載體,構建His-ORF120表達質粒。將NONO基因片段分別連接至pcDNA3.1-mCherry和pCMV-N-FLAG載體上,構建mCherry-NONO質粒和N-FLAG-NONO質粒。用于質粒構建的引物如表1所示。

表1 引物序列

1.2.3酵母雙雜交篩選 為了明確ORF120蛋白與宿主蛋白的互作,首先將擴增的病毒ORF120基因連接到pGBKT7載體上,用pGBKT7-empty作為對照,在SDO(SD/-Trp)、SDO/X(SD/-Trp/X-α-Gal)和SDO/X/A(SD/-Trp/X-α-Gal/AbA)平板上驗證pGBKT7-ORF120載體對酵母細胞的自激活和毒性。之后,將表達pGBKT7-ORF120的酵母菌株(Y2HGold)和文庫酵母菌株(Y187)雜交,利用Western blot檢測ORF120的表達情況;在DDO/X/A(SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA)板上選擇陽性菌落,根據其在QDO/X/A培養基上的生長情況對其進行鑒定,提取陽性質粒并進行PCR和測序鑒定。將質粒pGBKT7-p53和pGADT7-T共轉化的細胞作為相互作用蛋白的陽性對照,而用pGBKT7-Lam和pGADT7-T共轉化的細胞作為陰性對照,根據酵母細胞在選擇性培養基上的生長情況來評估所檢測蛋白質的相互作用。

1.2.4免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP) 利用Co-IP進一步確定病毒ORF120蛋白與宿主因子NONO之間的相互作用。將GFP-ORF120和N-Flag-NONO質粒分別共轉染HeLa細胞和OFTu細胞,轉染后24 h,收獲細胞、裂解,用抗GFP或抗Flag抗體4℃孵育6 h后,利用蛋白A/G瓊脂糖珠收集結合蛋白。最后,將產生的免疫沉淀用PBS洗滌3次,進行SDS-PAGE和Western blot分析。

1.2.5激光共聚焦觀察 分別在HeLa細胞和OFTu細胞中共轉染GFP-ORF120和mCherry-NONO質粒,轉染后24 h,用PBS洗滌細胞3次,經4%多聚甲醛固定15 min,并用0.025% Triton X-100滲透處理。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h后,用DAPI染核,并用激光共聚焦顯微鏡觀察。為了進一步證實ORF120蛋白和宿主蛋白NONO的相互作用,將缺失病毒OV-SY17Δ120和拯救病毒OV-SY17-RV120(MOI=10)模擬感染或感染OFTu細胞。然后,用4%多聚甲醛固定細胞,0.025% Triton X-100滲透,5%脫脂奶粉封閉后,用抗NONO抗體于4℃ 進行孵育。然后以Alexa Fluor 594標記的山羊抗兔抗體或Alexa Fluor 488標記的羊抗兔抗體在37℃ 孵育1 h,最后,用DAPI 染核,并用共聚焦顯微鏡觀察熒光。

1.2.6Western blot檢測 為了進一步研究ORF120蛋白與宿主因子NONO表達的相關性,將His-ORF120質粒和N-Flag-NONO質粒分別共轉染OFTu細胞或HeLa細胞,轉染24 h后,收集細胞,裂解,提取蛋白后進行免疫印跡分析。

2 結果

2.1 酵母雙雜交篩選確定宿主NONO蛋白為ORF120互作蛋白為了確定ORF120蛋白在細胞中的互作蛋白,首先提取OFTu細胞的mRNA(圖1A),并反轉為cDNA(圖1B),然后構建OFTu細胞的cDNA文庫,并成功構建了誘餌載體pGBKT7-ORF120。當pGBKT7-ORF120在酵母細胞中表達時,pGBKT7-ORF120轉化酵母感受態細胞在SDO(SD/-Trp)培養基上的生長速率、狀態與陽性對照無明顯差異,且pGBKT7-ORF120轉化酵母感受態細胞在SDO/X(SD/-Trp/X-α-Gal)和SDO/X/A(SD/-Trp/X-α-Gal/AbA)培養基不能生長成正常菌落,因此,pGBKT7-ORF120無毒性和自激活(圖1D)。隨后,將表達pGBKT7-ORF120的酵母菌株(Y2H Gold)和文庫酵母菌株(Y187)雜交,Western blot檢測顯示ORF120在Y2H gold酵母細胞中正常表達(圖1C);然后,用ORF120篩選來自OFTu細胞的cDNA文庫,觀察到酵母細胞呈現出三葉草的形狀(圖1E)。將選定的菌落轉移到DDO/X/A(SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA)板上,并在QDO/X/A板(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA)進一步鑒定,獲得正常生長且變藍的陽性菌落,利用PCR以及測序進行鑒定(圖1F)。序列比對分析發現了一種位于大多數哺乳動物細胞核中的多功能核蛋白,即非POU結構域八聚體結合蛋白(NONO)。為了進一步證實ORF120蛋白和NONO蛋白的相互作用,用質粒pGBKT7-p53和pGADT7-T共轉化的細胞作為陽性對照,而用pGBKT7-Lam和pGADT7-T共轉化的細胞作為陰性對照。質粒pGBKT7-Lam和pGADT7-T或pGADT7-NONO共轉化的酵母細胞,以及pGBKT7-ORF120和pGADT7-T共轉化的酵母細胞,均不顯示藍色。而質粒pGBKT7-ORF120和pGADT7-NONO共轉化的酵母細胞,在SD選擇板上觀察到強烈的生長現象(圖1G),表明ORF120蛋白和NONO蛋白之間存在相互作用。

A,B.OFTu細胞mRNA及cDNA電泳檢測;C.Western blot檢測Y2Hgold酵母細胞中ORF120蛋白的表達情況,p53蛋白作為陽性對照;D.pGBKT7-ORF120的表達、自激活和毒性檢測;E.轉化酵母細胞在光學顯微鏡下的生長情況;F.酵母雙雜交陽性菌落的PCR鑒定;G.質粒pGBKT7-ORF120和pGADT7-NONO的生長情況

2.2 Co-IP證實ORF120蛋白與宿主NONO蛋白之間的相互作用為了進一步證實ORF120蛋白與宿主蛋白NONO存在相互作用,對GFP-ORF120和N-Flag-NONO質粒轉染的HeLa細胞和OFTu細胞的蛋白提取物進行Western blot分析,并用抗GFP或抗Flag抗體檢測。與對照組相比,ORF120蛋白與宿主蛋白NONO發生免疫共沉淀(圖2A,B),進一步證實ORF120與NONO蛋白的相互作用。

A.GFP-ORF120和N-Flag-NONO質粒轉染HeLa細胞的蛋白提取物的Western blot檢測結果;B.GFP-ORF120和N-Flag-NONO質粒轉染OFTu細胞的蛋白提取物的Western blot檢測結果

2.3 ORF120蛋白與NONO蛋白存在共定位現象利用激光共聚焦顯微鏡觀察ORF120蛋白與宿主NONO蛋白的定位分布。ORF120主要分布于細胞質,在細胞核中僅有少量點狀分布。如圖3A所示,GFP-ORF120和mCherry-NONO質粒共轉染HeLa細胞后,ORF120與NONO在細胞核邊緣存在共定位現象;共轉染OFTu細胞時,2種蛋白在胞核略靠近邊緣處存在明顯的共定位現象(圖3B)。此外,分別用拯救病毒OV-SY17-RV120和缺失病毒OV-SY17Δ120感染OFTu細胞,由于蛋白表達量低,為觀察到明顯現象延長了感染時間,導致細胞核出現明顯變形。觀察發現,被拯救病毒OV-SY17-RV120感染的OFTu細胞中, RFP-ORF120蛋白與NONO蛋白也存在共定位,而被OV-SY17Δ120感染的細胞中未觀察到共定位現象(圖3C)。上述結果證實ORF120蛋白與NONO蛋白存在共定位現象,為進一步研究病毒ORF120蛋白與宿主NONO蛋白的互作提供理論依據。

A.GFP-ORF120和mCherry-NONO質粒轉染HeLa細胞中ORF120與NONO蛋白的共定位現象(箭頭標出);B.GFP-ORF120和mCherry- NONO質粒轉染OFTu細胞中ORF120與NONO蛋白的共定位現象(箭頭標出);C.攜帶RFP熒光標記拯救毒株(OV-SY17-RV120)和攜帶GFP熒光標記缺失毒株(OV-SY17Δ120)感染細胞中ORF120與NONO蛋白的共定位觀察(箭頭標出)

2.4 ORF120蛋白與宿主NONO蛋白存在劑量依賴性的相互抑制作用為了進一步確定ORF120蛋白與宿主蛋白NONO的互作關系,利用Western blot檢測His-ORF120和N-Flag-NONO共轉染OFTu細胞或HeLa細胞中ORF120蛋白和NONO蛋白的表達水平。結果顯示,在ORF120過表達的OFTu細胞和HeLa細胞中,NONO表達量下降(圖4A,C),而NONO過表達的OFTu細胞和HeLa細胞中,ORF120表達也呈現降低趨勢(圖4B,D),表明ORF120蛋白和NONO之間存在劑量依賴性的相互抑制。

A,C.ORF120蛋白過表達的OFTu細胞和HeLa細胞中NONO表達量下降; B,D.NONO蛋白過表達OFTu細胞和HeLa細胞中ORF120表達量呈下降趨勢

3 討論

目前,ORFV被證實可通過自身編碼的多種免疫調節因子調節宿主的抗病毒反應,然而,其如何通過劫持宿主細胞實現感染和復制的機制尚不清楚[7],從病毒與宿主角度出發,深入開展宿主蛋白在ORFV感染過程中的功能研究,將為解析ORFV免疫逃逸機制奠定基礎。本課題組的前期工作證實,病毒ORF120蛋白主要分布于細胞質,是與病毒毒力相關的蛋白;同時,ORF120蛋白可通過與胞漿G3BP1蛋白的結合對NF-κB天然免疫信號通路進行調節[16]。由于ORF120蛋白被觀察到在胞核中也有少量分布,那么胞核是否存在與其互作的宿主蛋白則有待于挖掘[17]。因此,本研究旨在通過進一步尋找與ORF120蛋白互作的宿主蛋白,為全面解析ORFV逃逸宿主的抗病毒免疫機制提供突破口。

NONO蛋白為DBHS蛋白家族的一員,可參與蛋白質-蛋白質以及蛋白質-核酸[18]的相互作用,調節多種正常生理活動,如在細胞遷移等方面發揮作用[19];另外,NONO蛋白也與多種腫瘤的發生發展、細胞免疫反應等密切相關,如參與cGAS介導的先天性免疫激活,可通過直接與病毒衣殼的結合來對抗病毒侵染[20]。作為參與細胞免疫的重要組分,該蛋白也是病毒感染過程中的重要調控靶標,人類免疫缺陷病毒(HIV-1)[14]、偽狂犬病病毒(PRV)[15]和EB病毒(EBV)[8]等多種病毒均可通過對NONO蛋白的調控逃避宿主免疫反應,促進自身的復制增殖。

在本研究中,我們使用酵母雙雜交系統研究了宿主因子與ORF120蛋白的相互作用,發現宿主NONO蛋白與ORF120蛋白具有相互作用。之后,結合免疫共沉淀、激光共聚焦共定位分析進一步驗證了兩者之間的互作。進一步利用Western blot檢測證實NONO蛋白與病毒ORF120蛋白表達存在劑量依賴性的相互抑制作用。過表達病毒ORF120蛋白能夠降低宿主因子NONO蛋白的表達,表明ORF120蛋白可通過對宿主因子NONO蛋白的調控參與ORFV復制環節的調節,為后期深入探討宿主NONO蛋白在ORFV感染過程中的功能研究提供重要理論依據,同時為全面解析ORFV致病機制以及抗病毒藥物靶點的篩選提供新思路。