奶山羊不同組織來源干酪性膿腫中偽結核棒狀桿菌的分離及毒力基因和耐藥性檢測

魏宇辰,王 斌,白新棟,王小園,王晨驍,王 娟,楊增岐

(西北農林科技大學 動物醫學院,陜西 楊凌 712100)

偽結核棒狀桿菌(Corynebacteriumpseudotuberulosis,C.pseudotuberulosis)為革蘭陽性球桿菌,是一種兼性細胞內寄生菌[1],能夠對多種動物和人造成感染,引發干酪性淋巴結炎[2](caseous lymphadenitis,CLA)。在諸多易感動物中,偽結核棒狀桿菌對羊的感染和侵害最為普遍,羊感染后又稱羊偽結核病,發病羊以體表下頜淋巴結、肩前淋巴結和腘淋巴結等處出現干酪性膿腫最為常見[3],由于該菌的理化性質和致病特點,在其對受感染羊只造成持久慢性損傷的同時,能夠對健康羊群產生長久感染威脅,由此也為該菌的防制和凈化帶來困難,已成為威脅羊群健康和養殖場經濟效益的頑固性病原之一。除體表型偽結核外,偽結核棒狀桿菌還能引起內臟型和混合型干酪性淋巴結炎[4-5],但由于內臟型偽結核難于肉眼觀察、羊群通常不開展偽結核棒狀桿菌的血清學普查、超聲和X線等診斷方法在羊病診斷中普及度較低等因素影響,內臟型偽結核多在屠宰過程和病死羊解剖時被發現,造成該病治療延誤且進一步增加羊群傳播風險。

此外,關于偽結核棒狀桿菌的生物分型,有學者提出根據硝酸鹽還原反應可將該菌分為2種生物型[6],分別為硝酸鹽還原反應陰性的生物I型(C.pseudotuberculosisbiovar ovis,羊種偽結核棒狀桿菌)和硝酸鹽還原反應陽性的生物Ⅱ型(C.pseudotuberculosisbiovar equi,馬種偽結核棒狀桿菌),且當前研究表明,羊源偽結核棒狀桿菌均為羊種偽結核棒狀桿菌[7]。我國當前對于羊內臟型和乳腺型偽結核以及病原菌生物型的報道較為少見。本研究從陜西關中地區奶山羊體表淋巴結、肺臟和乳腺組織成功分離到9株偽結核棒狀桿菌,并對分離菌開展病原學研究和比較,能夠進一步豐富羊偽結核病的研究資料,對研究羊偽結核病的防制和評估該病的公共衛生安全危害具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 樣品來源不同組織來源的9份干酪性膿腫內容物均采自陜西藍田某養殖場中的9只奶山羊。

1.2 采樣方法下頜淋巴結膿腫和乳腺膿腫樣品的采集:經患處消毒后,均使用20 mL一次性無菌注射器刺入膿腔抽取內容物約2 mL,分裝于無菌離心管中2 h 內低溫運送至實驗室;肺臟膿腫內容物樣品來自2只4 h內死亡送檢羊,解剖后肺臟表面消毒,使用無菌剪刀鑷子采集干酪性膿腫組織。

1.3 主要試劑5%綿羊血瓊脂培養基為實驗室自制;硝酸鹽還原反應試劑盒購自青島海博生物(貨號:HB8282);細菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;引物合成和基因測序由西安擎科澤西生物技術有限公司完成;2×Taq PCR Master Mix和DL2000 DNA Marker購自北京迪寧生物科技有限公司;抗生素標準品購自大連美侖生物技術有限公司;96孔微量反應板購自耐思生物科技有限公司;病理組織切片由西安依科生物技術有限公司制備;50只8周齡SPF小鼠(BALB/c)購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.4 組織涂片于載玻片上滴少許無菌生理鹽水,使用無菌接種環蘸取少量膿腫內容物與生理鹽水涂抹均勻,火焰固定后進行革蘭染色,鏡檢。

1.5 細菌分離培養在超凈工作臺內使用無菌接種環蘸取少量膿腫內容物,3區劃線接種于5%綿羊血瓊脂培養基,倒置于電熱恒溫培養箱中(36±1)℃培養48 h,之后挑取單菌落接種于血瓊脂培養基,使用相同培養條件進行純化培養。

1.6 細菌16S rRNA基因PCR擴增和測序鑒定經純化培養后,挑取單菌落,使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA,以提取的DNA為模板,使用細菌16S rRNA基因PCR擴增通用引物[8]27 F(5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇)和1492 R(5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇),目的片段大小為1 465 bp,反應體系為20 μL,反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35個循環;72℃延伸10 min。

1.7 硝酸鹽還原試驗將培養物接種于5 mL硝酸鹽肉湯, (36±1)℃培養72 h,加入對甲基苯磺酸溶液和α-萘酚乙酸溶液各2～3滴,混勻后觀察結果,出現紅色為陽性反應,不變色為陰性反應,如出現陰性結果,可再加入鋅粉少許,若出現紅色,則鑒定為陰性結果,若不變色則為陽性結果。

1.8 毒力基因PCR檢測根據文獻[9]所述的引物和PCR程序,以分離菌的DNA為模板,對整合膜蛋白(integral membrane protein,FagA)、鐵腸菌素轉運子(iron enterobactin transporter,FagB)、ATP結合胞質膜蛋白(ATP binding cytoplasmic membrane protein,FagC)和含鐵細胞-鐵結合蛋白(iron sidero-phore binding protein,FagD)進行基因檢測[10],擴增產物條帶大小分別為245,291,173,226 bp。磷脂酶D(phospholipase D,PLD)基因的PCR擴增,使用Primer Premier 5設計引物,上游引物為PLD-F:5′-ATAAGCGTAAGCAGGGAG-3′,下游引物為PLD-R:5′-GGTAGCCAGATGGTGAGTAG-3′,按常規PCR方法進行擴增,反應體系為20 μL,退火溫度為55℃,擴增產物條帶大小為611 bp。

1.9 動物致病性試驗將分離的菌株使用含5%血清的BHI肉湯培養基擴增培養后,每一分離株使用無菌PBS溶液將菌液濃度調整至約106CFU/mL。將50只小鼠隨機分為10組(n=5),9組試驗組小鼠分別腹腔注射0.1 mL 9株分離菌菌液,對照組小鼠腹腔注射0.1 mL無菌PBS溶液,于注射后第7天處死并解剖小鼠,觀察病理變化并制備病理切片。

1.10 藥物敏感性試驗選取青霉素(PEN)、萬古霉素(VAN)、頭孢噻肟(CTX)、慶大霉素(GEN)、環丙沙星(CIP)、紅霉素(ERY)、四環素(TET)和復方新諾明(SXT)共8種藥物,使用微量肉湯稀釋法進行最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)檢測,培養基為含5%小牛血清的CAMHB肉湯,菌液濃度為0.48～0.56麥氏值,根據美國臨床和實驗室標準協會(clinical and laboratory standards institute,CLSI)文件中規定的偽結核棒狀桿菌折點范圍判定結果。

2 結果

2.1 組織涂片和菌落形態臨床發病羊膿腫組織(圖1)內容物經制片和革蘭染色鏡檢后,可見單個散在或聚集存在的革蘭陽性球桿狀菌體,無莢膜和芽胞(圖2A);膿腫組織內容物培養48 h后于血瓊脂平板上可見乳白色、邊緣較整齊、干燥易于刮落的菌落(圖2B),挑取單菌落進行革蘭染色和鏡檢,顯微鏡下可見與膿腫組織涂片中形態一致的菌體。

A.下頜淋巴結膿腫;B.肺臟膿腫;C.乳腺膿腫

A.組織抹片鏡檢(1 000×,Gram);B.血平板培養單菌落

2.2 細菌16S rRNA基因的PCR擴增和測序鑒定PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后,可見約1 465 bp的條帶(圖3),與預期大小一致,經16S rRNA基因測序和序列比對表明,分離的細菌均為偽結核棒狀桿菌。將下頜淋巴結樣品源菌株編號為X1～X5,肺臟樣品源菌株編號為F1、F2,乳腺樣品源菌株編號為R1、R2。

M.DL2000 DNA Marker;(-).陰性對照

2.3 硝酸鹽還原試驗所獲得的9株羊不同組織來源的偽結核棒狀桿菌硝酸鹽還原反應均為陰性,表明分離的9株偽結核棒狀桿菌均為羊種偽結核棒狀桿菌(生物Ⅰ型)。

2.4 毒力基因PCR檢測對分離菌的毒力基因PCR檢測結果表明,分離的9株不同組織源偽結核棒狀桿菌均攜帶PLD、FagA、FagB、FagC、FagD基因(圖3)。

2.5 動物致病性試驗試驗組小鼠解剖后可見注射部位出現干酪樣化膿灶。病理組織切片顯微鏡下可見腸系膜淋巴結出現急性淋巴結炎、淋巴細胞壞死和巨噬細胞浸潤;肝臟可見肝索結構不清,肝竇內可見少量淋巴細胞和中性粒細胞;脾臟可見壞死性脾炎,白髓區局部壞死,易見巨核細胞(圖4),對照組小鼠未見異常。

A.注射部位膿腫; B.腸系膜淋巴結(100×,HE); C.肝臟(100×,HE); D.脾臟(100×,HE)

2.6 抗生素敏感試驗經過對9株分離菌進行MIC檢測和結果判定,結果表明,分離菌對萬古霉素、慶大霉素、環丙沙星、四環素和復方新諾明敏感率為100%,對青霉素只表現為耐藥或中度敏感,對紅霉素存在一定程度耐藥,對頭孢噻肟敏感或中度敏感,試驗結果見表1,圖5。

表1 分離菌MIC檢測結果

圖5 分離菌對不同藥物的耐藥性

3 討論

羊源偽結核棒狀桿菌的研究報道正在引起諸多專家學者的關注,本研究對同一養殖場來源的羊下頜淋巴結、肺臟和乳腺干酪性膿腫組織中病原菌進行分離鑒定,最終從9份樣品中均分離到偽結核棒狀桿菌,且對試驗小鼠均有致病性,能夠引起小鼠局部化膿性病變和淋巴結等組織炎性反應。在細菌分離鑒定過程中發現,膿腫組織來源的偽結核棒狀桿菌在初次分離培養時生長緩慢,在血瓊脂培養基中至少培養48 h才能出現較為明顯的特征性菌落,因此,在初次分離培養時,應提供充足的培養時間。生物型鑒定結果顯示,本次所獲得的9株細菌均為羊種偽結核棒狀桿菌,該結果與國外學者研究結果一致[6-7],進一步證實根據硝酸鹽還原反應進行該菌生物分型的可行性。主要毒力基因鑒定表明,本研究中不同組織來源的偽結核棒狀桿菌菌株攜帶的主要毒力基因類型一致,均攜帶PLD、FagA、FagB、FagC、FagD基因,本研究中未發現不同組織來源與毒力基因類型之間存在差異,AQUINO等[9]雖發現不同組織來源的偽結核棒狀桿菌毒力基因類型存在差異,但在其研究的168株偽結核棒狀桿菌中,同時攜帶該5種毒力基因的菌株占比高達95.23%(160/168),由此可以表明PLD/FagA/FagB/FagC/FagD為偽結核棒狀桿菌的主要毒力基因型,能夠為該菌的特異性基因診斷方法開發提供一定參考。耐藥性研究結果表明,分離菌對青霉素和紅霉素耐藥率較高,對頭孢噻肟有耐藥趨勢,臨床用藥應予以關注,其中,分離菌對青霉素耐藥程度由高到低依次為下頜源、乳腺源和肺臟源菌株,可能與體表和乳腺膿腫易于發現并及時進行青霉素局部治療有關;肺臟源菌株對紅霉素均耐藥,可能與大環內酯類藥物在有呼吸道癥狀病羊的治療中普遍應用有關。但本研究中肺臟源和乳腺源菌株數量較少,關于該菌的耐藥性現狀研究仍需進一步擴大菌株數量。

當前,關于羊偽結核病的報道大多以羊淺表淋巴結干酪性膿腫為主[11-12],本研究中除病羊下頜淋巴結外,從肺臟化膿灶和乳腺炎性膿腫中亦分離到偽結核棒狀桿菌,表明偽結核棒狀桿菌能夠對羊多種組織器官造成局部化膿性感染,由此說明,針對偽結核棒狀桿菌對羊群的危害,除關注體表型感染外,還應對羊內臟型偽結核病予以群體篩查,此外,由于偽結核棒狀桿菌為人畜共患病原菌[13],乳腺炎性膿腫組織中偽結核棒狀桿菌的存在,應引起養殖場和畜牧獸醫工作者的重視。同時提示該菌不僅會對羊奶產業造成相關經濟損失,同時可能會對食品安全和公共衛生健康造成一定威脅。