豬鏈球菌2型轉座子文庫構建及毒力基因篩選

楊求磊,吳 桐,閆廣謀,李 娜,李豐陽,雷連成

(1.吉林大學 動物醫學學院 教育部人獸共患病研究重點實驗室,吉林 長春 130062)

豬鏈球菌(Streptococcussuis,SS)是一種重要的人獸共患病病原菌,可引起豬腦膜炎、敗血癥、心內膜炎、關節炎和肺炎等疾病,給養豬業造成巨大的經濟損失[1]。SS可經飛沫或傷口接觸而感染人,導致腦膜炎和中毒性休克綜合征(STSS)等疾病,威脅人類健康。SS屬于革蘭陽性兼性厭氧球菌,根據其莢膜抗原的不同,被分為29個血清型[2]。其中又以豬鏈球菌2型(Streptococcussuisserotype 2,SS2)流行最廣,致病性最強,危害最重[3]。SS2的致病性強弱與其毒力因子有關,目前為止已經發現了多種與SS2致病性相關的毒力因子,主要包括莢膜多糖、胞外因子、溶菌酶釋放蛋白、豬溶血素、谷氨酸脫氫酶、纖粘連蛋白等[4-5]。但是一些研究表明這些毒力因子的單個或多個缺失對某些菌株毒力的影響并不明顯,提示上述毒力因子在SS2致病性上可能協同發揮作用以及存在新的毒力因子或毒力因子基因決定簇[6]。因此,鑒于SS2較強的人獸共患性,挖掘新的SS2毒力因子對防控SS2感染具有重要意義。

轉座因子或轉座子是一類在很多動物中(包括線蟲、昆蟲和人等)發現的可自由移動的跳躍因子,可以自主復制及跳躍插入到某功能基因中,引起該基因失活,產生突變體[7]。目前研究最成熟的是Himar1轉座元件,該元件分離自西方角蠅,是在細菌誘變中應用最廣泛的Mariner家族轉座子,可編碼催化轉座酶蛋白,并在無處不在的TA二核苷酸位點插入,且Himar1轉座不需要寄主特異性因子,因此,該元件已成為在細菌基因組中進行隨機突變的先進工具[8]。本研究利用Himar1轉座誘變體系構建SC-19菌株的突變體文庫,其中,pMar4S是專為隨機誘變SS而設計的穿梭載體,該載體攜帶有TnYLB-1轉座子、高溫敏感的SS復制子以及依賴σA 啟動子引導的 Himar1 轉座酶[9]。高溫條件下,pMar4S質粒無法復制,在Himar1 轉座酶的催化作用下,TnYLB-1 轉座子可以插入到SS2基因組任意的TA序列中,導致基因被隨機誘變失活,進而構建突變體文庫[10]。根據表型變化設計試驗篩選突變菌株,通過生物檢測等方法鑒定基因位點,選擇毒力下降明顯的基因進一步研究,并建立SUT2基因敲除株、回補株,對其生長特性進行觀察,通過小鼠致病性試驗了解其致病性。本研究為進一步闡明 SS2 的致病機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑和儀器 SS2 SC-19菌株由本實驗室于2005年分離自感染SS2的病豬。pMar4S質粒由南京農業大學馬喆教授饋贈;大臘螟幼體,0.35～0.40 g,購自諾摩寵物用品企業店;BALB/c小鼠,6～8周,20～22 g,雌性,購自遼寧長生生物科技有限公司;本研究所用的限制性內切酶TaqⅠ、T4連接酶、HindⅢ、EcoRⅠ、Taq 酶均為 TaKaRa 公司產品;卡那霉素 (Kan+) 和壯觀霉素 (Spc+) 均購自 Sigma 公司;其他試劑均為國產分析純;所用引物見表1;基因測序均由吉林省庫美生物科技有限公司完成。

表1 引物及相關信息

1.1.2培養條件 SS2 SC-19在BHI培養基中,37℃條件下培養;含有轉座子的SS在28℃ 條件下,于含有100 mg/L卡那霉素(Kan+)的BHI培養基上培養;SS突變體在37℃ 條件下,于含有100 mg/L 卡那霉素(Kan+)的BHI培養基上培養;參考天根質粒提取試劑盒提取質粒。

1.2 方法

1.2.1SC-19菌株感受態的制備 用接種環取少量SC-19凍存菌液,3區劃線于BHI平板,置于37℃溫箱,過夜培養。挑取平板上的單菌落,接種至5 mL液體BHI,37℃、180 r/min 振蕩培養12 h。將培養的菌液1∶100轉接至含DL-蘇氨酸的液體BHI(DL-蘇氨酸終濃度40 mmol/L),37℃、180 r/min 振蕩培養至D=0.3～0.5;冰浴15～30 min,5 000 r/min、4℃離心10 min,收集菌體;先用預冷的EB重懸菌體,洗滌2次,再用預冷的15%甘油重懸,洗滌1次,加入約1%最初菌體體積的15%甘油重懸;100 μL/管分裝,-80℃保存。

1.2.2SC-19菌株的轉化 取總量1 μg的 pMar4S質粒加至100 μL SS2感受態中,輕輕吹打混勻,全部轉移至預冷的0.1 mL電轉杯中,并將電擊杯置于冰上冰浴20 min;擦干電轉杯,設置電壓2 500 V進行電轉;電轉后立即加入1 mL復蘇液,并轉移至2 mL 無菌EP離心管中,28℃、180 r/min 振蕩培養2 h;取50 μL涂布于含Kan+(100 mg/L)的BHI平板,37℃培養過夜,誘導轉座。

1.2.3高溫誘導TnYLB-1轉座子插入SC-19菌株基因組 挑取含Kan+(100 mg/L)的 BHI平板上長出的單菌落,對點劃線于含Kan+(100 mg/L)的BHI平板及Spc+(100 mg/L)的BHI平板,37℃培養過夜。轉座子片段TnYLB-1中含卡那霉素抗性篩選基因,pMar4S質粒中除轉座子片段之外還存在1個Spc+(100 mg/L)抗性篩選基因,故可篩選出抗Kan+(100 mg/L) 而不抗Spc+(100 mg/L)的突變菌株。構建SS2突變體文庫,并統計pMar4S質粒應用于SS2的轉座效率。

1.2.4突變體TnYLB-1 插入的PCR驗證 隨機挑取18株SS2突變體文庫中的轉座子突變株,接種至含Kan+(100 mg/L)的液體BHI,37℃、180 r/min進行增菌培養。取菌液為模板,以引物oITR 通過PCR檢測轉座子TnYLB-1的基因片段。反應程序參考文獻[11]:95℃ 5 min;94℃ 45 s,66℃ 60 s,72℃ 2 min,30個循環;72℃ 10 min。

1.2.5突變體菌株的大臘螟攻毒試驗 用SS突變體感染大臘螟(G.mellonalla)幼蟲。用10 μL 不同突變SS菌株的接種物在左后前肢感染幼蟲,這些菌株的濃度為1 × 107CFU/mL,每隔6 h 記錄1次幼蟲的存活率直至72 h[12]。在感染試驗中,將1× 107CFU/mL的SS作為陽性對照,用PBS作為陰性對照。

1.2.6反向PCR檢測轉座子插入位點 用限制性內切酶TaqⅠ在65℃對突變株的基因組酶切4 h,用試劑盒純化酶切產物,然后用T4DNA連接酶進行連接,使DNA片段環化[11]。利用引物oIPCR1和oIPCR2對環化的DNA進行反向PCR(inverse PCR,IPCR)擴增。擴增程序:94℃ 5 min;94℃ 30 s,47℃ 30 s,72℃ 2 min,30個循環;72℃ 5min。對PCR產物進行測序及序列比對分析,確認轉座子插入位點。

1.2.7SUT2基因缺失菌株的構建與鑒定 以提取的SC-19菌株的基因組為模板,采用引物A1/A2和A3/A4分別經PCR擴增SUT2基因的上、下游同源臂,通過融合PCR融合上下游同源臂,以EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切同源臂的PCR擴增產物,以EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切pSET4S,通過T4連接酶于16℃連接,將連接產物轉化DH5α大腸桿菌感受態中,構建重組質粒,經PCR和測序鑒定正確后命名為pSET4S-S。將pSET4S-S電轉入SC-19菌株,28℃振蕩培養2 h后加入Spc+(100 mg/L),振蕩培養10 h,接菌于新的培養基中,于37℃擴大培養12 h,將培養物(1∶100)轉接至BHI液體培養基,28℃繼續培養12 h后,傳3代,涂布于BHI瓊脂平板,37℃培養至長出單菌落并挑取單菌落涂布于含Spc+( 100 mg/L )的BHI瓊脂平板,陽性菌株不能在含Spc+(100 mg/L)的BHI瓊脂平板上生長。

1.2.8SUT2基因回補菌株的構建與鑒定 以SUT2基因缺失菌株為模板,設計引物將目的基因PCR擴增后用SphⅠ和BamHⅠ雙酶切,回收后再與用相同內切酶處理的質粒載體pSET2進行連接,轉化連接產物至DH5α感受態中,PCR和測序鑒定正確后,將含重組表達質粒的菌株命名為pSET2-U。將pSET2-U通過電轉化至缺失株△SUT2感受態中(方法如1.2.2),加入復蘇液BHI,振蕩培養2 h,再加入含Spc+(100 mg/L)的BHI液體培養基,37℃、180 r/min振蕩培養12 h,取菌液劃線于含Spc+(100 mg/L)的固體BHI平板,培養24 h,挑取單菌落于含Spc+(100 mg/L)的BHI液體培養基中,并通過引物Y1/Y2進行PCR,測序后通過生物信息學比對分析進行鑒定。

1.2.9生長曲線測定 將SS2野生株SC-19、缺失株△SUT2和回補株C△SUT2劃線接種于BHI固體培養基上,37℃培養箱培養18 h,挑取單菌落,在試管中37℃、180 r/min振蕩培養12 h。次日利用分光光度儀將各菌株培養液的D600值調至一致,按 1∶100比例接種到新鮮的BHI液體培養基中,37℃、180 r/min振蕩培養。以BHI液體培養基為空白對照,每隔1 h 無菌取樣,用分光光度計測定培養物D600值,連續測定10 h,比較野生株SC-19菌株缺失株△SUT2和回補株C△SUT2的D600值差異。

1.2.10小鼠致病性試驗 從BHI平板上挑取野生株SC-19、缺失株△SUT2和回補株C△SUT2的單克隆,轉接于5 mL新鮮培養基中,37℃、180 r/min搖床中12 h,5 000 r/min離心5 min,用PBS清洗3遍,調整D600=0.8;調整菌液濃度至 1×1010CFU/mL;將40只雌性、體質量(18±2) g的BALB/c小鼠隨機分為4組,每組10只,第1組注射PBS,其余3組分別腹腔注射野生株SC-19菌株、缺失株△SUT2和回補株C△SUT2,各組每只小鼠注射100 μL菌液濃度為1×1010CFU/mL菌液,觀察BALB/c小鼠的存活狀況。

2 結果

2.1 高溫誘導TnYLB-1轉座插入SC-19菌株基因組在高溫條件下TnYLB-1被誘導隨機插入到豬鏈球菌的基因組,而pMar4S質粒的殘余部分會消失,質粒上的壯觀霉素抗性也會隨之消失。因此,根據同一單菌落在含卡那霉素抗性的BHI培養基上能夠生長,而在壯觀酶素抗性的BHI培養基上不能生長的特性,挑取了450個突變體,pMar4S質粒應用于SS2的轉座效率達到83.33%(轉座效率=壯觀霉素敏感菌株數/卡那霉素敏感菌株數)。

2.2 突變體TnYLB-1 插入的PCR驗證從SC-19菌株的突變體文庫中隨機挑選了18個突變體,PCR檢測結果(圖1)表明,18個突變體基因組DNA中都擴增出約1 342 bp的片段,同質粒pMar4S為模板(陽性對照)擴增出的片段大小一致,而從野生型SC-19菌株基因組中不能擴增出該片段,說明TnYLB-1的轉座插入成功。

M.DL2000 DNA Marker;1～18.突變株樣本;19.陽性對照;20.陰性對照

2.3 突變體菌株的大臘螟攻毒試驗將注射10 μL SS2 (1×107CFU/mL)的大臘螟作為陽性對照,其死亡率為100%;試驗組大臘螟注射10 μL 突變株 (1×107CFU/mL),記錄0,6,12,24,30,36,42,48,54,60,66,72 h大臘螟幼蟲的活動、繭形成、黑化以及生存情況,判定突變體表型變化的菌株[12],最終確定8株毒力減弱的突變體。根據最終鑒定得到的突變株的基因位點,繪制大臘螟數據圖(圖2)。

圖2 SS2感染大臘螟幼蟲健康評分的比較

2.4 反向PCR檢測轉座子插入位點利用反向PCR擴增18株毒力減弱的突變株(圖3),其中毒力最弱突變株側翼序列的大小為888 bp。PCR樣品經測序后進行生物信息學分析,利用NCBI的BLAST工具對上述致病性減弱的突變株的pMar4S轉座子插入位點側翼序列進行比對,并分析插入位點基因及編碼產物,最終確定8個插入位點基因(表2),分別編碼二氨基庚酸脫羧酸、M24金屬肽酶、兩種假設蛋白、ABC轉運通透酶亞基、磷酸吡哆醛依賴性氨基轉移酶、ABC轉運蛋白結合底物、核糖核酸G和E。

M.DL2000 DNA Marker;1.SC-19;2.陰性對照;4～21.18株突變文庫中突變株樣本

表2 TNYLB-1轉座子插入位點

2.5 缺失株△SUT2構建及鑒定利用A1/A4引物進行PCR,鑒定△SUT2基因敲除重組載體(圖4),并對PCR產物進行測序,利用正確的基因敲除重組載體,通過同源重組方法構建△SUT2基因敲除株,利用目的基因外部引物通過PCR鑒定△SUT2敲除株(圖5),并對PCR產物進行測序和序列比對。

M.DL2000 DNA Marker;1.重組載體質粒樣本;2.陽性對照;3.陰性對照

M.DL2000 DNA Marker;1.陽性對照;4.陰性對照;2～3.樣品;5～8.樣品

2.6 回補株C△SUT2的構建及鑒定利用Y1/Y2引物通過PCR鑒定回補重組載體C△SUT2(圖6)和回補株C△SUT2(圖7),并對PCR產物進行測序和序列比對,確定C△SUT2回補株構建成功。

M.DL2000 DNA Marker;1～5.樣品.6.陽性對照;7.陰性對照

M.DL2000 DNA Marker;1～3.樣品;4.陽性對照

2.7 生長曲線測定生長曲線顯示,△SUT2突變株較SC-19菌株生長遲緩,C△SUT2回補株相較△SUT2突變株生長緩慢,野生型、敲除型、回補型菌株經歷約2 h遲緩期后進入對數生長期,8 h后進入平臺期,且△SUT2缺失株和C△SUT2回補株在平臺期菌液D600 nm值較野生株低(圖8)。

圖8 SC-19、△SUT和C△SUT生長曲線測定

2.8 小鼠致病性試驗結果顯示,在7 d內,注射PBS的對照組小鼠始終保持活躍狀態,注射1×109CFU/mL SC-19組的小鼠在18 h死亡1只,24 h 死亡5只,36 h死亡8只,48 h死亡10只,在48 h小鼠死亡率為100%。注射相同菌量的△SUT2敲除菌株小鼠在攻毒后7 d內無死亡情況,在12 h精神萎靡,24 h恢復正常精神狀態。注射相同菌量的C△SUT2回補菌株小鼠在24 h死亡2只,36 h死亡1只,48 h死亡1只,直至168 h無任何死亡情況。表明SC-19菌株在缺失△SUT2基因后對小鼠的致死率顯著降低(圖9)。

圖9 SC-19、△SUT和C△SUT小鼠存活率測定

3 討論

本研究利用有TnYLB-1轉座子片段的pMar4S質粒構建SS2 SC-19菌株突變體轉座子文庫。研究發現pMar4S質粒對SC-19菌株的轉座效率達到了83.3%,說明pMar4S質粒適用于建立SS2轉座子文庫。利用大蠟螟毒性試驗篩選18株致病性減弱突變株,通過IPCR及序列比對確定8種毒力基因。IPCR結果顯示篩選的突變體基因組為轉座子單插入,并且插入位置不同,說明轉座子隨機、單拷貝插入SC-19菌株文庫的構建非常成功。但是IPCR過程往往出現非特異性條帶及彌漫性條帶,片段自連效率及片段大小都可能導致IPCR失敗,這也就導致只篩選出18株毒力致弱的突變株,最終只確定8種毒力因子,這也是Mariner轉座子一個缺點,無法快速分析插入位點。構建敲除株△SUT2和回補株C△SUT2,通過小鼠致病性試驗進一步明確,敲除△SUT2基因的菌株與野生型相比毒力下降100%,回補C△SUT2基因的菌株對小鼠死亡率為40%。推測可能涉及碳水化合物轉運或ABC轉運蛋白的多效性有關。

Himar1轉座元件是在細菌誘變中應用最廣泛的 Mariner 家族轉座子[13]。基于Mariner1轉座原件構建的穿梭載體pMar4s及其攜帶的TnYLB-1已經成為SS轉座誘變及基因功能研究的新型有效工具,已成功應用于SS2的抗吞噬研究[14]。目前,SS無法通過單個毒力基因或多個毒力基因協作確定是強毒株還是弱毒株[6]。本研究通過穿梭載體pMar4s構建SC-19菌株突變體文庫,篩選毒力減弱缺陷型突變體,最終確定8個毒力相關基因,分別為二氨基庚而酸脫羧酸、M24金屬肽酶、兩種假設蛋白、ABC轉運通透酶亞基、磷酸吡哆醛依賴性氨基轉移酶、ABC轉運蛋白底物結合蛋白、核糖核酸G和E。

ABC轉運蛋白底物結合蛋白和ABC轉運蛋白通透酶亞基,都屬于腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白,內含1個腺苷三磷酸而得名。ABC是生物體中最大的轉運蛋白超家族。在原核生物中,ABC轉運蛋白可以攝取營養物質,并將毒素和藥物排除體外。ABC多重耐藥轉運蛋白在肺炎鏈球菌中可以排出有毒物質,并能夠輸出毒力因子參與定植和感染宿主細胞[15]。ABC轉運蛋白和金屬離子對化膿鏈球菌的生長和毒力很重要[16],碳水化合物的獲取和代謝對細菌生長、增殖及致病能力很重要。現已證明參與碳水化合物攝取和代謝的蛋白質有助于SS的致病性[17]。有研究表明,有多種鏈球菌可以形成生物膜, ABC轉運系統的蛋白也許會影響SS的生物膜形成。

在結核桿菌中,磷酸吡哆醛依賴性氨基轉移酶是小鼠生長和毒力所必需的[18]。此外,磷酸吡哆醛依賴性氨基轉移酶可能在能量產生、細胞膜、運動性、趨化性、翻譯后修飾和鐵相關機制中起重要作用[19]。因此,推測磷酸吡哆醛依賴性氨基轉移酶可能具有多效性。二氨基庚二酸脫羧酶是磷酸吡哆醛(PLP)依賴性酶,對微生物生長和致病性至關重要。二氨基庚二酸脫羧酶是催化細菌二氨基庚二酸生物合成途徑的最后一步,反應的產物是必需氨基酸l-賴氨酸,它是合成細菌的肽聚糖細胞壁、看家蛋白質和毒力因子的重要前體[20]。肽酶M24超家族是由許多不同類型的蛋白質組成的復雜群體。有研究表明M24金屬蛋白肽酶PepP,PepP是一種參與介導彎曲桿菌病的新的毒力決定簇[21]。核糖核酸G和E屬于Rpi,是一種高度保守的蛋白酶,參與原核和真核生物的戊糖磷酸途徑,反應的產物或成為糖酵解的中間體,或成為合成核苷酸、維生素、氨基酸和細胞壁成分[22]。另兩種假設蛋白需要進一步驗證。

環境的不同可引起一系列基因的共同表達,包含毒力基因和非毒力基因,一些非毒力基因的產物也可能參與協助毒力基因的某些功能,因此SS引起的中毒性休克綜合征、腦膜炎等病理變化往往需要一系列的物質共同協調完成。本研究篩選出8個毒力相關的基因,并選擇ABC轉運蛋白家族未知基因(ARL70172.1)進行基因敲除和回補,通過小鼠試驗證明毒力基因敲除株的毒力下降明顯,為進一步研究SS致病機制和藥物治療奠定了基礎。