豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定、血清分型及耐藥性分析

張哲瑋,曹維維,代小童,甘 晶,饒 靜,袁 龍,貝為成

(1.華中農業大學 動物醫學院 農業微生物學國家重點實驗室,湖北 武漢 430070;2.湖北洪山實驗室,湖北 武漢 430070;3.廣西揚翔農牧有限責任公司,廣西 貴港 537100;4.生豬健康養殖協同創新中心,湖北 武漢 430070)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)屬于巴氏桿菌科,巴氏桿菌屬,是動物呼吸道重要病原菌,可造成豬、牛、羊、兔、禽、野生動物和寵物等多種宿主感染,具有極強的致病性[1]。豬Pm能引發豬肺疫和豬萎縮性鼻炎[2],造成嚴重的呼吸道癥狀并誘發其他病原混合或繼發感染,增加死亡率,降低飼料轉化率,對我國養豬業造成嚴重的經濟損失[3]。根據Pm莢膜抗原的差異,可將其分為A、B、D、E、F 5種血清型,其中A型和D型主要引起豬肺疫,此外D型還可以引起豬傳染性萎縮性鼻炎,而B型則能引起出血性敗血癥。近10年,我國Pm的優勢血清型主要為A型和D型,但研究顯示A型的檢出率已逐年高于D型[4-6]。目前Pm的商品化疫苗無法提供有效保護,豬場更多依賴抗生素進行防治,然而濫用抗生素造成的多重耐藥現象給該病的防控帶來了極大挑戰。

本研究通過收集不用地區規?；B豬場中具有呼吸道癥狀豬的口鼻拭子及組織病料,通過細菌分離鑒定、生化試驗及血清分型,明確豬多殺性巴氏桿菌病在該地區的流行現狀,進而對分離菌株的耐藥性和致病性進行探究,旨在為豬場的精準用藥、減緩Pm耐藥性及疫苗的研發提供科學依據和防控方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病料及試驗動物 病料主要來源于廣西、湖北、內蒙古3個省規?；B豬場中有呼吸道癥狀豬的口鼻拭子及組織病料。SPF級,6～8周齡,體質量20 g左右的雌性昆明小鼠購買及飼養于華中農業大學實驗動物中心。

1.1.2培養基及主要試劑 胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA)購自BD Difco公司;DL2000 DNA Marker、2×Taq Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司;新生牛血清購自AusgeneX公司;革蘭染色試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司;細菌藥敏紙片和細菌微量生化反應管均購自青島海博試劑有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.1.3主要儀器設備 酶標儀Victor NIVO 3S(南京萊醫特電子科技有限公司);DNA純度和質量檢測分光光度計(Beckman公司);紫外分光光度計(美國Thermo公司);多功能顯微鏡(日本OLYMPUS公司);圖像采集系統(日本OLYMPUS公司);恒溫培養箱(上海新苗醫療器械制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1病豬口鼻拭子及組織病料的收集與處理 對收集到的有呼吸道癥狀豬只的口鼻拭子和組織病料樣品進行記錄,記錄后對樣品進行處理?？诒鞘米拥奶幚?將拭子放入裝有適量生理鹽水的EP管中充分混勻。病料的處理:首先用酒精棉輕輕擦拭病變較為明顯的病料表面,并用點燃的酒精棉來回經過至表面干燥,用消毒后器械將病料剪成“口”字型,用未接觸環境的內側面輕輕涂布平板。

1.2.2病原菌分離培養及革蘭染色 將處理后的口鼻拭子及無菌剪取的肺臟等病變組織,劃線接種于含10%新生牛血清的TSA平板上,置于37℃恒溫培養箱培養18～24 h,挑取疑似菌落并進行傳代培養,取純培養物進行革蘭染色、鏡檢。

1.2.3生化試驗 參考常見細菌系統鑒定手冊[7],無菌挑取純培養物于葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、海藻糖、山梨醇等12種生化反應管中,37℃培養24～48 h,觀察并記錄結果。

1.2.4細菌基因組DNA的提取 細菌基因組DNA的制備根據天根生物公司的細菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟進行操作。

1.2.516S rDNA的PCR鑒定及測序比對 以步驟1.2.4制備的細菌基因組DNA作為模板進行細菌16S rDNA的PCR檢測,用通用引物擴增16S rDNA全長序列,上游引物序列:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;下游引物序列:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′,預計擴增片段長度1 500 bp 左右。PCR擴增體系:PrimerSTAR Max Premix(2×) 10 μL,H2O 7 μL,上、下游引物各1 μL,模板1 μL,總計20 μL。擴增程序:95℃預變性5 min; 95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1.5 min,共30個循環;72℃最后延伸10 min。用含有EB染料的1.1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增產物,將鑒定正確的PCR產物送往武漢擎科生物公司進行測序,并將測序結果與GenBank中已有序列進行BLAST比對。

1.2.6莢膜血清型分型 莢膜血清型分型鑒定所用引物參考文獻[8],引物序列見表1。PCR反應體系:PrimerSTAR Max Premix(2×)10 μL,H2O 7 μL,上、下游引物各1 μL,模板1 μL,總計20 μL。反應程序:95℃預變性5 min;95℃變性1 min,58℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30個循環;72℃延伸10 min。用含有EB染料的1.1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增產物。

表1 莢膜血清型分型鑒定引物及相關信息

1.2.7生長曲線的測定 將本次分離菌株與實驗室前期分離并保存的PmA、PmD菌株于含10%新生牛血清的TSA平板上劃線復蘇,37℃過夜培養,挑取單菌落傳代一次,再挑取單菌落到含10%新生牛血清的TSB中,恒溫搖床振蕩培養12 h作為種子液。將上述種子液按1∶100轉接種于含10%新生牛血清的TSB中,37℃、180 r/min振蕩培養12 h,期間每隔1 h取樣測D600 nm值,根據測定結果繪制生長曲線。

1.2.8藥敏試驗 采用Kirby-Bauer法對20種藥品進行藥敏試驗。將分離菌株于含10%新生牛血清的TSA平板上劃線復蘇,37℃過夜培養,挑取單個菌落接種于含10%新生牛血清的TSB中,于37℃振蕩(180 r/min)培養12 h,用生理鹽水調整菌液濃度至0.5麥氏單位(1.5×108CFU/mL)。用滅菌棉簽蘸取適量菌液均勻涂布于含10%新生牛血清的TSA平板上,待培養基表面充分吸收菌液后放置藥敏紙片,并使其緊貼培養基表面,于37℃恒溫培養箱培養18～24 h,測量抑菌圈直徑,記錄測量結果,并根據杭州微生物試劑有限公司藥敏結果判定標準評價菌株對藥物的敏感性。

1.2.9小鼠致病性試驗 將分離菌株與實驗室前期分離并保存的PmA、PmD菌株分別接種于含10%新生牛血清的TSB中,于37℃振蕩培養12 h并進行細菌計數。將小鼠分為9組(其中感染組8組、對照組1組),每組5只小鼠。用生理鹽水將菌液稀釋至攻毒濃度(PmA型菌株攻毒濃度為40 CFU/只,PmD型菌株攻毒濃度為2×105CFU/只),感染組小鼠腹腔注射0.2 mL稀釋菌液,對照組小鼠腹腔注射0.2 mL無菌生理鹽水,同時對實際攻毒菌液進行細菌計數。各組小鼠攻毒后隔離飼養,觀察并記錄臨床癥狀、死亡情況等,同時剖檢死亡小鼠并做細菌分離鑒定。

2 結果

2.1 病原菌分離培養及染色鏡檢將病料在TSA平板上接種培養,挑取單菌落純化后,從廣西及內蒙古病豬肺臟中分離到6株疑似Pm菌株。分離菌株在TSA平板上生長良好,37℃過夜培養后,可見培養基上長出圓潤、灰白色、透明或半透明的菌落,且PmA型菌株比PmD型菌株菌落表面更為黏膩,革蘭染色鏡檢均可見短桿狀或球桿狀的革蘭陰性菌(圖1)。

A,C.Pm血清A型菌株的菌落形態;B,D.Pm血清D型菌株的菌落形態

2.2 生化特性鑒定將分離的臨床菌株進行生化試驗,結果顯示6株分離菌株的生化結果一致,能發酵多種單糖、雙糖及醇類,但不發酵乳糖,海藻糖,枸櫞酸鹽、尿素酶、甲基紅,V-P試驗結果為陰性,吲哚試驗結果為陽性,將鑒定結果與《伯杰細菌鑒定手冊》比對分析,符合Pm的生化特性(表2)。

表2 分離菌株的生化鑒定結果

2.3 16S rRNA基因序列分析及比對用通用引物對6株臨床分離菌株進行PCR擴增,結果顯示,在1 500 bp處有特異性條帶,與預期相符(圖2)。將擴增產物送至武漢擎科生物公司進行測序,并將測序結果在NCBI上進行比對分析,結果顯示6株分離菌株與Pm的相似性均在97%以上。

M1.DL2000 DNA Marker;1～6.分離菌株;7.陰性對照

2.4 血清型分型鑒定用5對分型引物對6株臨床分離菌株進行PCR擴增,結果顯示,6株Pm中有1株為莢膜血清A型(條帶大小為1 044 bp),其他5株為莢膜血清D型(條帶大小為657 bp)(圖3)。

2.5 生長曲線測定結果將臨床分離菌株與實驗室前期分離并保存的PmA、PmD型菌株分別進行生長曲線測定,結果顯示,Pm血清A型、Pm血清D型菌株均在7 h左右時達到對數生長期,10 h左右達到平臺期,雖然不同菌株間生長曲線的走勢不完全相同,但均顯示出基本一致的生長狀態(圖4,5)。

圖4 Pm血清A型菌株生長曲線

圖5 Pm血清D型菌株生長曲線

2.6 耐藥性分析藥敏試驗結果顯示,6株臨床分離菌株對米諾環素、多西環素、四環素、卡那霉素、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢拉定、頭孢唑啉、頭孢氨芐、哌拉西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、青霉素等藥物均表現為敏感,且對β內酰胺類藥物表現出高度敏感;其中GX-PmA對新霉素、丁胺卡那中度敏感。NMG-PmD5對紅霉素中度敏感,對新霉素和慶大霉素耐藥。

2.7 致病性試驗致病性試驗結果顯示,在感染后5 h,部分小鼠開始出現運動減少、食欲減退的現象;在感染后10 h,可見小鼠精神萎靡、雙眼蒙蔽、背毛雜亂,對外界刺激反應遲緩。GX-PmD4組小鼠攻毒后死亡時間最短,于10 h出現死亡,PmA組、GX-PmA組小鼠攻毒后20 h出現死亡,其余小鼠死亡時間多發生于20～24 h,而PmD組、GX-PmD2組小鼠未出現死亡,對照組小鼠均未出現死亡(表3)。結果證實Pm血清A型菌株小鼠致病性強于Pm血清D型菌株,且PmA及GX-PmD4菌株對小鼠的致病性強于其他分離菌株。

表3 分離菌株對昆明小鼠的致病性結果(n=5) 只

剖檢小鼠可見,對照組未見明顯病變,感染組小鼠臟器可見其不同程度的出血,其中肺臟出血較為明顯,脾臟充血腫大,部分小鼠肝臟出現淤血或局部有壞死點(圖6)。收集死亡小鼠肺臟進行細菌分菌鑒定,結果顯示平板上菌株的菌落形態與Pm一致,經PCR鑒定證實小鼠肺臟分離菌為Pm(圖7)。

A,B,C.分別為對照組小鼠肺臟、肝臟、脾臟;D,E,F.分別為攻毒組小鼠肺臟、肝臟、脾臟

M1.DL2000 DNA Marker;1～16.分離菌株;17.陰性對照

3 討論

豬Pm是危害我國生豬業健康發展的重要呼吸道病原菌,臨床上常與多種細菌、病毒及支原體混合感染,在冬春季節環境多變、豬群抵抗力低下時,常造成內源性感染,影響豬群正常生長發育、降低飼料轉化率、增加養殖費用,還可引發急性死亡,造成嚴重的經濟損失[9]。本研究通過大量收集臨床病料并通過細菌分離培養、染色鏡檢以及生化鑒定、PCR檢測等方法成功分離出6株豬Pm,其中莢膜血清A型1株,D型5株,這與我國目前流行的優勢血清型一致[10]。近年來,常有在豬群中分離到莢膜血清F型Pm的報道,且被證實有較強的致病力,因此Pm F型菌株也可能成為未來我國豬群中流行的重要血清型之一,這可能是未來豬Pm流行病學調查的重點[11-13]。

隨著集約化養殖模式的發展,豬呼吸道疾病的發病率激增,抗生素濫用現象導致細菌的多重耐藥現象屢見不鮮。我國學者對2017年我國臨床分離菌株的耐藥情況分析顯示,Pm對青霉素、磺胺類、氨基糖苷類藥物的耐藥率相對較高。本研究顯示廣西臨床分離菌株未見耐藥現象,這可能與分離菌株來自于不同的區域及養殖場日常用藥情況相關,但內蒙古分離株表現出明顯的新霉素、慶大霉素耐藥現象,這與近年來的文獻報道較為一致[14]。有研究證實,針對目前流行的Pm,β-內酰胺類藥物(青霉素、氨芐西林和頭孢噻呋)、大環內酯類藥物(替米考星)和氟喹諾酮類藥物(恩諾沙星)比推薦使用的土霉素和氟苯尼考更為有效[15]。因此,預防為主、防治結合的科學思維必不可少,在日常養殖中,應結合養殖場實際情況制定科學合理的防控措施,做好飼養管理工作,密切關注豬群生長狀況,定期對豬舍及相關用具進行消毒,同時做好圈舍通風工作,及時掌握豬群耐藥情況并結合臨床報道的有效抗菌劑進行治療具有重要意義[16-17]。因此,一旦豬只發病,應結合醫囑實施藥物治療,并持續監測呼吸道病原體的耐藥性,以減少該病帶來的經濟損失。

本研究通過對分離菌株及實驗室保存的菌株進行毒力分析比較,證實Pm血清A型菌株對小鼠的致病力強于D型菌株,這與相關文獻報道結果一致[18],同時從分離菌株中篩選出了致病力較強的分離菌株PmA和GX-PmD4,為實驗室后期滅活苗的制備及新型疫苗的研究奠定了基礎。隨著基因組學的不斷發展,Pm強弱毒株之間的差異逐漸被挖掘出來。研究證實,盡管強弱菌株間的基因組高度相似,但其在臨床癥狀、病理變化、組織細菌載量、共有毒力基因的體內轉錄水平等方面仍存在較大差異[19-22]。因此,強毒株的篩選對后期的致病性機制研究、篩選差異毒力基因、疫苗的研發等工作奠定了基礎。