禽致病性大腸桿菌體外感染雞巨噬細胞模型的建立

石海濤,譚躍榮,申思陽,彭璐媛,伊鵬霏,付本懂

(吉林大學 動物醫學學院,吉林 長春 130062)

雞大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)引起的一種禽類細菌性疾病,作為家禽養殖業中常見的群發病,飼養環境、應激反應或者其他疾病均可成為此病發生的誘因[1]。

巨噬細胞作為肺臟中常駐免疫細胞,成為大腸桿菌呼吸道感染的第一道免疫防線,對雞抵抗大腸桿菌感染具有重要作用[2]。

目前雞大腸桿菌病模型,大多用大腸桿菌直接感染雞體,例如腹腔注射,灌胃,胸肌注射等[3],但尚未建立成熟穩定的大腸桿菌體外感染巨噬細胞HD11的方法,并且HD11細胞的培養條件大多維持在37℃,并未模擬雞的體溫在41℃條件下培養[4]。因此,本研究通過采用APEC-O78感染HD11細胞,通過比較不同感染復數,不同感染時間,不同溫度下APEC感染HD11細胞后,炎癥基因表達的變化,篩選出最佳感染條件,建立穩定的APEC體外感染模型。

1 材料與方法

1.1 菌液制備APEC-O78菌株來自中國獸醫微生物菌種保藏管理中心,將菌種干粉進行活化,鑒定后劃線培養,取單菌落于LB肉湯培養基中進行培養,測定生長曲線,并取對數期細菌待用。

1.2 細胞培養與傳代HD11細胞由揚州大學朱國強教授惠贈,使用RPMI-1640培養基、8%胎牛血清,2%雞血清配制完全培養基,待HD11細胞長滿T25細胞培養瓶后,棄掉培養基,加入1 mL預熱的PBS清洗細胞后,加入300 μL胰酶(Gibco)消化15 s 棄掉,加入2 mL完全培養基,使用1 mL移液槍吹打細胞至脫落后,轉移至2 mL離心管,使用離心機1 000 r/min離心5 min,棄上清,使用完全培養基混懸后,分至2個T25細胞培養瓶,放入37℃、5% CO2細胞培養箱中培養。

1.3 2種溫度對APEC增殖的影響以5 g∶200 mL 的比例,配制LB肉湯培養基(青島海博生物技術有限公司)于2個錐形瓶,各100 mL,各加入100 μL對數期APEC菌液,分別培養于37℃與41℃搖床中,間隔2 h以Q6000測定其D600 nm,繪制生長曲線。

1.4 APEC感染對HD11細胞損傷的檢測將細胞以1×105/孔接種至48孔板,于37℃培養箱中培養12 h后,棄培養基,以MOI=50、MOI=51、MOI=52、MOI=53的感染復數,將APEC接種至48孔板,分別在0.5,1,2,4,6 h吸取培養基上清,離心去除沉淀后,使用碧云天LDH檢測試劑盒按照說明書檢測細胞上清中LDH含量。

1.5 熒光定量PCR法檢測不同感染復數大腸桿菌在連續時間內對HD11細胞炎性基因表達的影響將細胞以1×106/孔接種至6孔板,于37℃培養箱中培養12 h后,棄培養基,以MOI=50、MOI=51、MOI=52、MOI=53的感染復數,將APEC接種至孔板內,分別在0.5,1,2,4 h時收集細胞。

1.6 熒光定量PCR法檢測不同感染復數APEC在2種溫度下對HD11細胞炎性基因表達的影響將細胞以1×106/孔接種至6孔板,培養12 h后,棄培養基,以MOI=53、MOI=52、MOI=51、MOI=50、MOI=5-1、MOI=5-2、MOI=5-3的感染復數,將APEC接種至6孔板,分別置于37,41℃含5% CO2恒溫培養箱培養,4 h后收集細胞。使用TRIzol法提取細胞總RNA,使用Q6000測定RNA的質量和質量濃度,以每個樣本1 μg的體系使用反轉錄試劑盒按照說明書進行反轉錄,采用20 μL的熒光定量PCR體系:cDNA模板1 μL,上、下游引物各0.5 μL,Roche FastStartTM通用SYBR?Green預混液(ROX)10 μL,并用無酶水補足至20 μL,采用3步法進行信號采集:95℃預變性10 min;95℃變性15 s,55℃退火20 s,60℃延伸30 s,40個循環。引物序列如表1所示。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.7 Griess法檢測細胞上清中NO水平將細胞以5×105/孔接種至24孔板,培養12 h后,棄培養基,以MOI=50、MOI=51、MOI=52、MOI=53的感染復數,將PAEC接種至24孔板,分別在41℃培養0.5,1,2,4 h后收集細胞上清,按照南京建成NO檢測試劑盒說明書對細胞上清進行處理,并用酶標儀測定各孔D550 nm值。

1.8 DCFH-DA法檢測細胞ROS水平將細胞以2×104/孔接種至24孔板,培養12 h后,棄培養基,使用純培養基清洗細胞3次,使用無血清培養基將DCFH-DA(Sigma)稀釋至10 μmol/L并加入到96孔板內,41℃孵育30 min后再次清洗干凈未裝載的探針,以MOI=50、MOI=51、MOI=52、MOI=53的感染復數,將APEC接種至孔板內,41℃培養,分別在0.5,1,2,4 h后,使用488 nm激發波長,525 nm發射波長,檢測熒光強度。

1.9 統計學分析所有數據經過Excel軟件初步處理整合后,使用SPSS 19.0統計軟件進行方差分析,使用繪圖軟件GraphPad Prism 9.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同溫度下APEC的生長曲線首先為了確定常規培養溫度37℃與試驗溫度41℃對APEC生長是否有影響,分別在2種不同溫度下對APEC的生長曲線進行測定。如圖1所示,APEC-O78在相同培養時間內,在不同溫度下顯示出相同的生長活性,并在前5 h內,其生長狀態無明顯差異。

圖1 不同溫度下大腸桿菌生長曲線

2.2 APEC感染對HD11細胞LDH的影響為了篩選出APEC對于HD11細胞的最大感染時間以及感染復數,確定對細胞無直接損傷的感染范圍,對不同感染復數在不同時間內HD11細胞培養上清的LDH進行檢測,以lysis作為陽性對照,結果如圖2所示,用不同MOI感染HD11細胞,在0～4 h,除MOI=53組在4 h有顯著變化外,其余各組細胞LDH釋放均無顯著變化;而當感染時間到達6 h,不同MOI感染細胞的LDH釋放量均顯著高于對照組,因此后續大腸桿菌感染HD11細胞的作用時間均小于4 h。

ns.表示P>0.05;*.表示P<0.05;**.表示P<0.01。下同

2.3 不同MOI APEC感染HD11細胞后炎性基因表達變化為了對比不同的APEC感染濃度在不同的感染時間內對于HD11細胞的影響,對APEC感染HD11細胞后相關炎癥因子進行檢測,結果如圖3所示,當APEC感染HD11細胞的作用時間為0.5 h時,炎癥基因的表達量與對照組相比并無明顯差異。當MOI=53,作用時間為1 h時,僅IL-6相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)。而當APEC感染HD11細胞的作用時間為2 h時,4種炎癥基因的相對表達量顯著高于對照組(P<0.05),但IL-6 mRNA相對表達量在MOI=53時與MOI=51、MOI=52時相比有降低趨勢。當APEC感染HD11細胞的作用時間為4 h,當MOI=50、MOI=51、MOI=52、MOI=53時,IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS的相對表達量均極顯著或顯著高于對照組(P<0.01或P<0.05);但當MOI=52、MOI=53時,4種基因的相對表達量相較于MOI=50、MOI=51時均有所降低。因此,在0～4 h內,4種基因的相對表達量呈時間依賴性,且在4 h時,4種炎癥基因的相對表達量達到峰值,但與感染復數并無正相關關系。

圖3 在時間梯度內不同MOI APEC感染對HD11細胞炎癥因子相對表達量的影響

2.4 不同溫度下APEC感染對HD11細胞、促炎基因表達的影響因4種基因的相對表達量在4 h時達到峰值,因此確定PAEC感染HD11的作用時間為4 h,并擴大感染復數的梯度范圍,以確定2種溫度下不同感染復數對4種基因表達的影響。如圖4所示,當培養溫度為41℃時,iNOS的相對表達量在不同MOI下,均顯著高于37℃(P<0.05),其中當MOI=50、MOI=51、MOI=52時,差異極顯著(P<0.01);IL-1β的相對表達量除MOI=5-3以外,均顯著高于37℃(P<0.05),其中MOI=51、MOI=52、MOI=53差異極顯著(P<0.01);IL-6的相對表達量在MOI=51、MOI=52、MOI=53時均顯著高于對照組(P<0.05),其他組無明顯變化;TNF-α的相對表達量在MOI=50、MOI=51、MOI=52、MOI=53時顯著高于37℃(P<0.05),其中當MOI=51時,差異極顯著(P<0.01)。可見當培養溫度為41℃時,HD11細胞對于大腸桿菌的反應活性顯著高于37℃。當MOI=51時,HD11細胞對PAEC的反應活性相對于其他感染復數更為強烈。

圖4 不同溫度下大腸桿菌感染HD11細胞對炎性基因表達的影響

2.5 APEC感染對HD11細胞IL-10、ROS以及NO的影響通過前面的試驗發現,APEC感染后HD11細胞的活化與感染時間和感染復數并無直接的正相關關系,為查明原因,我們對HD11細胞的IL-10、ROS以及NO的變化進行分析。

2.5.1在梯度時間內不同感染復數APEC感染對HD11細胞IL-10基因表達的影響 如圖5所示,IL-10在共培養1 h以內無明顯變化,當時間達到2 h后,IL-10的表達顯著升高(P<0.05)。

圖5 不同MOI APEC感染在0～4 h內對HD11細胞IL-10基因表達的影響

2.5.2在梯度時間內不同感染復數APEC感染對HD11細胞NO分泌的影響 為探究不同的感染時間下,不同濃度APEC感染HD11細胞后對NO的產生的影響,使用NO檢測試劑盒對培養上清進行檢測,如圖6所示,利用不同MOI APEC感染HD11細胞,不同時間內NO含量具有明顯的變化。其中孵育時間為0.5 h,MOI=52、MOI=53組內NO含量顯著上升(P<0.05),隨著時間延長至1 h,MOI=53組NO含量極顯著升高(P<0.05),但當時間到達2 h時,雖然MOI=52、MOI=53組NO含量仍高于正常組,但相比于之前的時間,MOI=53組的NO含量有所下降,當時間到達4 h后,MOI=53組的NO含量顯著下降(P<0.01),而其他組逐漸趨于正常。

圖6 不同MOI APEC對HD11細胞在0～4 h內NO釋放的影響

2.5.3在梯度時間內不同感染復數APEC感染對HD11細胞ROS的影響 已知促炎因子會導致巨噬細胞M1型極化,可以引起ROS的產生,因此對APEC感染后HD11細胞的ROS變化進行檢測,如圖7所示,HD11細胞在受到感染刺激后,0.5 h時ROS水平具有顯著升高(P<0.05),且與MOI呈正相關,隨著時間延長至4 h,MOI=53組的ROS水平顯著高于正常組,但當時間為4 h時,MOI=52、MOI=53組的ROS水平相較于2 h有所降低。

圖7 不同MOI APEC感染在0～4 h內對HD11細胞ROS的影響

3 討論

巨噬細胞作為大腸桿菌突破免疫屏障的第一道防線,建立體外大腸桿菌感染模型是研究大腸桿菌致病機制的另一種途徑。本研究在建立模型的過程中發現,大腸桿菌感染巨噬細胞的作用時間并非是越久越好,當時間達到6 h后,大腸桿菌在不同感染復數下,都可對巨噬細胞產生嚴重的破壞,引起LDH顯著升高,在4 h左右,巨噬細胞的反應就可達到最大值,當確定作用時間后,篩選感染復數過程中發現,因大腸桿菌復制速度較快,過高的感染復數非但不會增強巨噬細胞反應性,相反對巨噬細胞炎性反應產生抑制作用,在LDH水平并無明顯變化的情況下,過高濃度的大腸桿菌可能會抑制巨噬細胞的某些作用。而不同的培養溫度也可能會導致巨噬細胞活性改變。禽巨噬細胞由BEUG等[5]建立之初,就培養于37℃下,后續研究也大多維持于37℃條件下[6],37℃對于細菌和細胞而言都是傳統的最佳培養條件,但是考慮到APEC與HD11細胞都來源于雞,因此對培養溫度是否應模擬雞的生理溫度(41.5±0.5)℃而產生疑問,因此在這2種溫度下進行了試驗。通過比較2種溫度下HD11細胞對APEC刺激的基因表達情況,發現41℃下HD11細胞的炎癥反應相較于37℃強烈的多。41℃作為雞的正常生理溫度,在應對APEC感染時,HD11細胞能夠產生更多的促炎因子,從而可以引起機體免疫系統針對APEC感染產生更好的防御能力,而37℃降低了HD11細胞的反應性,或許這可以解釋飼養環境溫度低會成為大腸桿菌病發生的誘因之一。但HD11細胞因抵抗APEC感染而導致促炎因子基因水平的提高并非沒有限制,相反,隨著感染時間的延長以及APEC數量的逐漸增多,HD11的活性也會受到抑制,其中TNF-α、IL-1β、IL-6這3種促炎因子,顯示出相同的變化趨勢,而 iNOS作為巨噬細胞M1型極化的一種標志性基因[7-8],其擁有促進巨噬細胞產生NO的作用[9],其表達趨勢的變化與促炎因子極為相似,即低感染濃度與高感染濃度都會產生較低的基因表達水平。當低感染濃度時, APEC的數量不足以誘導HD11細胞活化,而高感染濃度相關基因表達水平低,可能與APEC具有某些免疫抑制的作用而相關。為了驗證這一結果,又對M2極化的一種標志基因—IL-10[10]進行檢測分析,結果發現隨著感染濃度的升高,IL-10反而有顯著升高的變化趨勢。當APEC感染濃度導致HD11細胞的3種促炎相關基因以及M1型標志基因iNOS的表達水平顯著降低時,IL-10的表達水平急劇升高,也因此可排除HD11細胞可能因感染而死亡導致RNA降解的可能性。類似于結核分枝桿菌會導致M1極化的巨噬細胞向M2表型轉換的現象[11],誘導巨噬細胞產生IL-10,有利于細菌在巨噬細胞內的存活和生長[12]。通過對HD11細胞產生ROS的水平進行檢測,發現M1型巨噬細胞支持ROS持續產生的功能受到抑制,因此認為對于APEC體外感染HD11細胞的濃度,需要限定在一定范圍之內。

綜上所述,HD11細胞在41℃條件下,相比于37℃,其對APEC感染具有更高的反應活性;在MOI=51時,其應對感染的產生的反應更劇烈,因此,本研究選擇使用MOI=51的APEC-O78作用于HD11細胞,41℃條件下培養4 h,可建立相對反應性較好的APEC體外感染巨噬細胞的模型,并可以此為基礎,從細胞水平上探究大腸桿菌與巨噬細胞之間的互作關系,進一步深入研究雞大腸桿菌的致病機制,為本病的防控提供理論依據。