顆粒蛋白前體PGRN通過增強ORFV誘導的自噬促進病毒的復制

甄瑞雪,呂麗君,陸慧君,劉興源,徐夢實,關繼羽,賀文琦,高 豐,趙 魁

(吉林大學 動物醫學學院 人獸共患病研究教育部重點實驗室,吉林 長春 130062)

羊傳染性膿皰病又稱羊口瘡(orf),是由羊傳染性膿皰病毒(orf virus,ORFV)感染引起綿羊、山羊以及多種野生動物的一種高度接觸性傳染病,人也可通過接觸發生感染[1]。ORFV是痘病毒科副痘病毒屬代表種,具有高度的嗜上皮性,主要引起感染動物口唇部、鼻周、乳房、外陰部以及蹄部皮膚的增生性病變,感染羊尤其是羔羊常因饑餓和繼發感染導致生長遲緩甚至死亡[2-3]。在人類,ORFV感染部位皮膚也出現水皰、膿皰等病變,后期形成潰瘍甚至結痂脫落,多表現為局部自限性病變[4]。目前,ORFV感染廣泛發生于世界各地羊群中,感染動物常出現生長及繁殖性能的下降,給養羊業造成嚴重的經濟損失[5-6]。

細胞自噬是真核生物的一種高度保守的由溶酶體介導的降解和循環過程。細胞可利用自噬清除和降解其自身破損、老化以及功能異常的細胞器和蛋白質,以維持細胞內穩態。此外,自噬也可清除入侵的病原體,是機體抵抗感染的重要機制之一[7-8]。在發生自噬時,細胞內形成一種稱為吞噬泡的小囊泡樣結構,包裹待降解產物形成具有雙層膜結構的自噬體,最終自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體,進而將底物降解[9-10]。盡管自噬被證實是一種有效應對病毒感染的防御機制,但多種病毒也進化出阻止或利用自噬的策略,以利于其自身的復制增殖[11]。

顆粒蛋白前體(progranulin,PGRN)是廣泛分布于各組織、器官和細胞中的一種分泌型多功能蛋白,參與了炎癥反應、創傷修復、神經發育、自噬等多種生命活動過程[12-13]。目前,越來越多的證據表明,PGRN是溶酶體功能的關鍵調控因子,它能夠被轉運至溶酶體并分解產生促進溶酶體功能的顆粒蛋白亞基,進而參與調節自噬[14]。課題組前期研究結果顯示,ORFV感染能夠誘導細胞自噬,并且隨著自噬水平的增加,病毒復制也隨之增強,然而PGRN是否參與對ORFV誘導自噬的調控及機制尚不清楚。鑒于此,本研究首先從轉錄和蛋白水平上分析了PGRN在ORFV感染細胞中的表達變化規律,并深入探討了PGRN對ORFV感染誘導自噬水平及病毒復制增殖的影響。本研究結果不僅有利于明確PGRN對ORFV誘導自噬水平的調控作用,而且將為進一步揭示ORFV致病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒和細胞ORFV/JL/08/CC毒株由本實驗室分離鑒定及保存[15];OFTu細胞由本實驗室分離培養及保存。

1.2 主要試劑高糖DMEM(美倫生物);高糖DMEM(2×)(吉諾生物);胰蛋白酶(新賽美生物科技有限公司);胎牛血清(BI公司);5×上樣緩沖液、RIPA蛋白裂解液(中)、Lipo8000TM轉染試劑、BCA試劑盒(碧云天生物);快速封閉液(雅酶生物);GAPDH抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔、抗鼠和辣根過氧化物酶(HRP)標記驢抗羊IgG(Proteintech公司);PGRN抗體(R&D公司);Progranulin/PGRN 蛋白(MCE);LC3B抗體(Sigma公司);PCR引物由吉林省庫美生物有限公司合成。

1.3 細胞培養與病毒感染將狀態良好且處于對數生長期的OFTu細胞進行傳代,以80%～90%細胞密度接種于6 cm一次性細胞培養皿中,培養18～24 h后,接種ORFV(MOI=10),分別收集感染后0,12,24,36,48,60 h的樣品進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot分析。

1.4 細胞轉染將OFTu細胞以70%～80%的密度接種于6孔細胞培養板中,培養18～24 h后進行轉染,在進行轉染前更換培養基,將每個孔都換成2 mL的新鮮培養液(1%青鏈霉素,10%FBS),然后再進行后續的細胞轉染操作:取1個潔凈無菌的1.5 mL離心管,分別依次加入125 μL 高糖DMEM、100 pmol/L siRNA、4 μL Lipo8000TM轉染試劑,并依次用槍輕輕吹打混勻,室溫孵育20 min后滴加至6孔板內,放入細胞培養箱繼續培養24 h后,將ORFV以MOI=10接種細胞,收集感染后48 h的樣品進行qRT-PCR、Western blot和病毒毒力測定。同時設立PGRN處理組,將OFTu細胞以70%～80%的密度接種于6孔細胞培養板中,培養18～24 h后以MOI=10接種ORFV,孵育1 h后將培養液更換為2 mL含1 000 μg/L PGRN重組蛋白、2% FBS的培養液,感染后48 h收集樣品進行qRT-PCR、Western blot和病毒毒力測定。

1.5 熒光定量PCR分析將細胞按照1.3和1.4方式進行處理后,提取細胞總RNA,將其反轉錄成cDNA后,應用特異性引物檢測PGRN mRNA的相對表達。反應參數:95℃ 2 min,94℃ 15 s,55℃ 15 s,68℃ 30 s,95℃ 15 s,60℃ 1 min,45個循環。以GAPDH作為內參,計算相對表達量,引物序列見表1。

表1 引物信息

1.6 Western blot檢測將細胞按1.3和1.4處理后,使用RIPA裂解液(PMSF濃度為1 mmol/L)將收集于1.5 mL離心管底部的細胞沉淀吹起并吹打混勻,冰上孵育30 min后,4℃ 12 000 r/min離心10 min,測定蛋白質量濃度。取蛋白樣品,進行12% SDS-PAGE,電泳后通過半干法將蛋白轉移至PVDF膜上,應用快速封閉液室溫封閉15 min后,用TBST沖洗1次,分別用PGRN、GAPDH、LC3B抗體4℃孵育過夜后,TBST清洗 3次,每次10 min,用辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔、抗鼠和抗羊IgG于37℃孵育1 h,用TBST清洗3次,每次10 min,用ECL法顯色后利用ImageJ軟件對蛋白條帶進行定量分析。

1.7 病毒噬斑試驗將OFTu細胞以80%～90%的密度接種于12孔板,培養18～24 h后,分別將相應的病毒液稀釋到原來濃度的10-3,對應每孔接種600 μL稀釋的病毒液,37℃、5% CO2孵育1 h后棄掉病毒液,加入2%低熔點瓊脂糖培養基,培養5 d后,棄掉上層瓊脂糖培養基,用4%多聚甲醛室溫固定15 min后,用2%結晶紫進行細胞染色,用清水沖洗3次后拍照分析。

1.8 統計學分析使用SPSS 20.0軟件進行統計學分析,P>0.05表示差異不顯著,*P<0.05表示差異顯著,**P<0.01表示差異非常顯著,***P<0.001表示差異極顯著。

2 結果

2.1 ORFV感染誘導PGRN表達上調收集ORFV感染后不同時間(0,12,24,36,48,60 h)的OFTu細胞樣品,分別提取感染細胞總蛋白及總RNA進行Western blot和qRT-PCR分析。利用Western blot對感染細胞中PGRN、ORFV及自噬相關蛋白P62、LC3蛋白表達的檢測結果顯示,ORFV誘導OFTu細胞自噬的發生時間為36 h,此時LC3開始發生型別轉換,P62下調;PGRN的表達量也在36 h開始顯著上調(圖1)。利用提取的感染后不同時間的OFTu細胞總RNA進行qRT-PCR測定,并利用Excel和SPSS軟件進行統計分析,結果如圖2所示,PGRN mRNA的表達呈時間依賴性增加。上述結果提示,PGRN表達的上調可能與自噬的發生相關。

圖1 Western blot檢測PGRN、ORFV及自噬相關蛋白P62、LC3蛋白的相對表達水平

圖2 qRT-PCR檢測PGRN mRNA表達情況

2.2 PGRN正向調節ORFV誘導的OFTu細胞自噬為明確PGRN與ORFV誘導OFTu細胞自噬之間的關系,將特異性靶向PGRN的siRNA#640、#1509、#1632轉染細胞,48 h后收取細胞樣品,分別提取細胞總蛋白和總RNA,利用Western blot和qRT-PCR檢測PGRN蛋白及mRNA表達情況。結果如圖3A所示,將PGRN靶向siRNA#640和siRNA#1632轉染細胞后,PGRN的蛋白質水平和mRNA表達顯著降低。選取#1632轉染OFTu細胞,轉染后24 h以MOI=10接種ORFV,接種后48 h 提取細胞總蛋白通過Western blot檢測PGRN、P62以及LC3蛋白表達情況,結果如圖3B所示,干擾PGRN后,P62的表達上調,抑制 LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的型別轉化。而在ORFV感染細胞中添加PGRN重組蛋白培養48 h后,提取細胞總蛋白,通過Western blot檢測PGRN、P62以及LC3蛋白表達情況,結果如圖3C所示,體外添加PGRN重組蛋白后,P62的表達下調并且促進LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉換。

A. 將siRNAs轉染OFTu細胞后,PGRN的蛋白和mRNA表達檢測;B. 干擾PGRN后,OFTu細胞感染ORFV后48 h LC3和P62蛋白表達檢測;C. 添加PGRN重組蛋白后,OFTu細胞感染ORFV后48 h LC3和P62蛋白表達分析

2.3 PGRN通過調控自噬影響ORFV復制為了探究PGRN對ORFV復制的影響,用siRNA#1632轉染OFTu細胞后,將ORFV以MOI=10分別接種siRNA#1632轉染后24 h的OFTu細胞以及添加重組PGRN蛋白的OFTu細胞,分別收集感染后48 h的病毒液進行病毒噬斑試驗,結果顯示,干擾PGRN抑制了ORFV的復制(圖4A),而體外添加PGRN能顯著促進ORFV的復制(圖4B)。為進一步明確PGRN是否通過對ORFV誘導的自噬水平進行調節而影響ORFV的復制,將ORFV以MOI=10接種至自噬抑制劑BafA1(20 nmol/L)預處理的細胞及正常OFTu細胞,孵育1 h后分別加入含有相同濃度的自噬抑制劑BafA1、BafA1+PGRN重組蛋白,收集培養48 h后的病毒液進行噬斑試驗,結果如圖4C所示,經自噬抑制劑BafA1處理的細胞中ORFV的毒力被顯著抑制,而添加PGRN重組蛋白的細胞中ORFV的毒力相對于單獨添加自噬抑制劑BafA1有所回升。上述結果表明,PGRN通過調節ORFV誘導OFTu細胞自噬水平影響ORFV的復制。

A.轉染siRNA#1632后,病毒復制能力變化檢測;B.體外添加PGRN后, 病毒復制能力變化檢測;C.BafA1+PGRN重組蛋白共處理后,病毒復制能力變化檢測

3 討論

羊口瘡(orf)又稱羊傳染性膿皰病、傳染性膿皰性皮炎,是主要發生于綿羊和山羊的一種高度接觸性傳染病,表現為皮膚/黏膜的增生性病變[16]。該病的病原ORFV具有高度的嗜上皮性,主要感染受損或疤痕皮膚,并在表皮角質細胞中復制。該病的病變通常表現為紅斑、丘疹、水皰、膿皰和結痂,主要發生于羔羊的口唇及鼻周部位,但乳房、陰部、蹄部也可發生感染[17-18]。由于單純ORFV感染多為自限性疾病,人們認為ORFV僅導致感染動物局部較為輕微的皮膚病變,從而忽視了ORFV感染對羊群乃至人的潛在危害。然而,ORFV傳染性強,且對外界環境抵抗力強,能夠在感染痂皮中存在數月甚至數年,可持續多年危害羊群,嚴重危害感染動物產毛、產肉、繁殖等生長與生產性能,給養羊業造成嚴重的經濟損失。此外,作為一種人獸共患病病原,ORFV潛在的公共衛生安全問題目前也已引起人們的重視。

自噬是一種在所有真核生物中高度保守的細胞降解和循環過程,通過胞質細胞器、蛋白質和大分子的降解以及分解產物的再循環,在細胞的生存和維持中發揮著重要作用[19]。在哺乳動物細胞中,自噬主要包括以下3種類型:微自噬、大自噬和伴侶蛋白介導的自噬(CMA)[20]。雖然每一種自噬都在形態上不同,但這3種類型都最終將底物運送到溶酶體進行降解,進而維持細胞內穩態[21]。雖然自噬能夠清除大多數的外來細菌和病毒,但許多病毒已經進化出一系列的策略來逃逸這種細胞防御機制,甚至可利用自噬來促進自身的復制。目前的研究表明,病毒可通過3種方式適應或調節自噬:一些病毒能夠抑制自噬的發生,例如人單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV-1)能夠編碼產生神經毒力蛋白ICP34.5,通過與自噬相關蛋白Beclin-1結合抑制自噬發生,進而減弱細胞防御對其自身復制的限制[22]。此外,一些病毒能夠誘發細胞產生不完全自噬,即在感染初期能夠促進細胞自噬,但后期可抑制自噬溶酶體形成,阻斷自噬內容物降解,例如人病毒性肝炎病毒(HCV)[23]和人狂犬病病毒(RV)[24]。然而,還有一些病毒能夠利用細胞自噬促進病毒自身的復制。本課題組前期研究證實,ORFV能夠誘導OFTu細胞發生完全自噬,并可利用自噬促進其自身的復制[25-31]。

PGRN作為分布廣泛的一種分泌型多功能蛋白,已被證實是參與自噬調節的重要分子。然而PGRN是否參與對ORFV誘導的自噬的調控及機制尚不清楚。鑒于此,本研究首先從轉錄和蛋白水平上分析了PGRN在ORFV感染細胞中的表達變化規律,結果顯示,ORFV感染后36 h PGRN發生顯著上調表達,該時間與ORFV激活OFTu細胞發生自噬的時間相一致,該結果提示,PGRN與ORFV誘導的OFTu細胞自噬存在關聯。為進一步確認,本研究分別利用siRNA靶向干擾PGRN或者體外添加PGRN重組蛋白的方法對PGRN進行抑制表達或過表達,檢測PGRN對自噬相關分子的影響,結果顯示,抑制PGRN能夠抑制LC3的型別轉換,并使P62上調表達;體外添加PGRN重組蛋白則促進LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉換,P62表達下調。以上結果表明,PGRN參與對ORFV誘導的細胞自噬的調控。本研究進一步探討了PGRN是否通過對ORFV誘導自噬水平的調控而影響病毒的復制,病毒噬斑試驗結果顯示,PGRN能夠促進ORFV復制,且可逆轉自噬抑制劑對病毒復制的抑制作用,該結果表明,PGRN能夠通過調節ORFV激活的自噬影響病毒的復制。本研究結果不僅有利于明確PGRN對ORFV誘導自噬的調控作用,而且將為進一步揭示ORFV的致病機制奠定基礎。