檢測牛副流感病毒3型恒溫隔絕式熒光RT-PCR方法的建立及應用

任云鑫,湯 承,2,岳 華,2*

(1.西南民族大學 畜牧獸醫學院,四川 成都 610041;2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室, 四川 成都 610041)

牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)為副黏病毒科(Paramyxoviridae)副黏病毒亞科(Paramyxovirinae)呼吸道病毒屬(Respirovirus)的成員,是引起牛呼吸道綜合征(bovine respiratory disease syndrome,BRDC)的重要病原之一[1]。BPIV3于1959年首次被分離到[2],根據系統發育分析可以將其分為BPIV3 A、B和C 3種基因型,多個國家都報道了存在不同基因型的BPIV3[3-6]。我國2008年首次報道BPIV3,已發現BPIV3 A、B和C基因型[4,7-8]。國內血清流行病學調查和分子流行病學調查資料顯示BPIV3在我國廣泛分布,并且在東北、西北和養牛業發達的中部地區具有較高的檢出率[8-12]。目前,國內關于BPIV3分子流行病學資料仍然缺乏,阻礙了BPIV3的進一步防控。

BPIV3感染后會引起牛的呼吸道損傷和免疫功能抑制[13],而表現出對BRDC的其他相關病原體易感性增強,導致病牛更嚴重的危害,致使牛群死亡率增加[14]。由于引發BRDC的病原較多且癥狀相似,因此,準確、快速、有效的檢測手段在BRDC的防控中顯的格外重要。PCR方法被認為是傳染病診斷的金標準[15],國內外已有根據BPIV3保守的N、M、HN、P基因設計的PCR檢測方法[16-22],但仍未見能夠基于現場快速診斷BPIV3的PCR方法,因此及時建立一種快速、靈敏、可靠地同時檢測BPIV3 A、B和C 3種基因型的熒光PCR方法,對BPIV3的診斷防控具有重要的現實意義。

恒溫隔絕式RT-PCR(insulated isothermal RT-PCR,iiRT-PCR)是一種基于貝納爾對流原理的等溫RT-PCR技術[23],配套使用PetNAD核酸提取試劑盒和POCKITTM系列核酸分析儀,無需設置反應程序,一鍵啟動后60 min內即可報告結果,具備操作簡單、檢測速度快的優勢,已廣泛用于多種動物疫病的現場檢測[24-27]。本研究根據GenBank中完整的102條P基因序列成功建立了BPIV3的現場檢測方法并進行了方法之間的比較和初步應用,豐富了國內關于BPIV3分子流行病學資料;為BRDC的診斷和分子流行病學調查提供了有力的工具。

1 材料與方法

1.1 病毒(菌)株與臨床樣品BPIV3 C基因型陽性核酸由本實驗室保存;用于通用性檢驗的BPIV3 A基因型(GenBank登錄號:JQ063064)和BPIV3 B基因型(GenBank登錄號:EU277658)毒株的目的序列片段由北京擎科生物科技有限公司成都分公司合成;用于特異性檢驗的病毒株、菌株的核酸陽性樣本:牛冠狀病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛呼吸道合胞體病毒(bovine orthopneumovirus,BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhoea virus,BVDV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis,IBRV)、牛腺病毒3型(bovine adenovirus type 3,BAV3)、牛鼻病毒(bovine rhinitis virus,BRV)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,P.multocida)、溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica,M.haemolytica)和牛支原體(Mycoplasmabovis,M.Bovis)的陽性核酸均由西南民族大學畜牧獸醫學院分子生物學實驗室保存。

P.BPIV3陽性對照;N.BPIV3 陰性對照;1～9.BCoV、BRSV、BVDV、IBRV、BAV3、BRV、多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏稈菌、牛支原體

P.陽性對照;N.陰性對照;-7～-12.4.23×103～4.23×10-2 copies/μL

141份BRDC肉牛鼻腔深部棉拭子樣本于2020-2021年采自我國內蒙古、河南、寧夏、山西、四川和福建6個省份, 50份BRDC牦牛肺臟樣本于2020-2021年采自四川省阿壩州紅原縣和若爾蓋縣的5個牧場。141份肉牛鼻腔深部棉拭子樣本每份按照1∶5比例直接加入PBS溶液后進行充分涮洗,而50份牦牛肺臟樣本則采用液氮冷凍研磨處理后,每份按照1∶5比例加入PBS溶液,所有樣本經渦旋混勻,10 000 r/min離心5 min后取上清由本實驗室保存于-80℃備用。

1.2 主要試劑和儀器Prime scriptTM反轉錄試劑盒、Premix Ex Taq(Probe qPCR)等購于TaKaRa 公司;pClone007載體、TrellefTM5α感受態細胞等購于擎科生物科技有限公司;Gel Extraction Kit和質粒提取試劑盒購自OMEGA BIO-TEK公司;高速冷凍離心機(5804)購自德國Eppendor公司;PetNAD核酸萃取試劑盒和POCKITTM系列核酸分析儀購于金瑞鴻捷生物科技有限公司。

1.3 引物、探針的設計與合成下載GenBank數據庫中已登錄的102條BPIV3 P基因序列,對比分析后選取高度保守的區域,使用Primer 5.0引物設計軟件設計了1對檢測BPIV3的特異性引物和1條特異性探針,擴增的目的片段位于基因組的2 830～2 954 bp處,長度為125 bp,引物序列:F:5′-ARAGGACACAGAAGAGAGCACT-3′,R:5′-TR-GCCACACATACAACTCTCT-3′;探針序列:FA-M-TTACAGAAAGGGCGATTACATTATTAC-AGA-BHQ1。引物和探針均由北京擎科生物科技有限公司成都分公司合成。

1.4 核酸的提取和反轉錄使用PetNAD核酸萃取試劑盒進行提取后,根據Prime scriptTM反轉錄試劑盒說明書對RNA進行反轉錄,cDNA保存于-20℃備用,而iiRT-PCR RNA的反轉錄和PCR檢測反應在同一個PCR毛細反應管中完成。

1.5 BPIV3 C基因型毒株陽性標準品的制備以反轉錄得到的cDNA作為陽性模板,用1.3中設計的引物進行RT-PCR擴增,得到的PCR產物使用電泳鑒定后,將其純化回收并用pClone007 載體、TrellefTM5α感受態細胞進行克隆轉化構建重組質粒作為 BPIV3 C基因型陽性標準品,并使用核酸蛋白分析儀測定其濃度,按照下述公式計算核酸濃度:質粒拷貝數(copies/μL)=(6.02×1023copies/mol)×(質粒濃度 g/mL)×10-3/(質粒分子量 g/mol)。

1.6 iiRT-PCR反應體系的優化利用控制變量法,50 μL iiRT-PCR反應體系中Premix Ex Taq預混酶為25 μL,反應體系主要是優化探針濃度10 μmol/L(0.05～0.35 μL)、引物濃度10 μmol/L(1～4 μL)、模板量(0.5～3.5 μL)和反轉錄酶20 U/μL(0.5～2 μL),以iiRT-PCR反應前后熒光比值最高為確定各自最優濃度及用量的判定標準。

1.7 特異性試驗采用反應體系優化后的BPIV3 iiRT-PCR方法對1.1中的病毒和菌株進行檢測,以評價該iiRT-PCR方法的特異性。

1.8 靈敏性試驗制備的BPIV3陽性質粒10倍遞增稀釋(1×100,1×10-1～ 1×10-12)后,使用優化后的iiRT-PCR方法進行檢測,確定該方法檢測下限。

1.9 重復性試驗取3個稀釋濃度(1×10-4～1×10-6)的BPIV3重組質粒標準品,用優化后的iiRT-PCR方法對每種濃度分別進行3次重復檢測,進行批內重復性試驗;對3個不同稀釋梯度的標準品進行3次獨立的重復檢測,進行批間重復性試驗,通過計算批內和批間變異系數評估該方法的重復性。

1.10 通用性試驗用建立的iiRT-PCR方法對1.4合成的BPIV3 A基因型和B基因型陽性標準品進行檢測并設立1.5制備的BPIV3 C基因型標準品為模板的陽性對照,另設置以ddH2O作為模板的陰性對照,用于評價該方法的通用性。

1.11 臨床樣本的檢測采用本試驗建立的iiRT-PCR方法和已報道的2種TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR方法[16,28],分別對191份臨床樣本進行檢測并比較檢出率,以評價該方法的符合性,檢測方法信息見表1。如果3種方法所檢出的陽性樣本編號不同,將其PCR產物進行雙向測序后來驗證結果的準確性。

表1 3種檢測方法信息

1.12 iiRT-PCR預混試劑的制備與現場應用為了滿足現場檢測,對1.6中描述的反應體系進行預混。將檢測4份樣本需要的檢測試劑按比例分裝預混為一管進行冷凍真空凍干,然后避光保存于-80℃,使用時只需加入緩沖液和模板即可開始檢測。取經1.11鑒定的2份陽性后和2份陰性BPIV3牛深部鼻腔棉拭子樣品驗證iiRT-PCR預混試劑的現場使用效果。將4份處理好的樣品使用商品化核酸提取試劑盒提取樣品總核酸后與溶解好的預混液一同加入到毛細PCR反應管中采用POCKITTM可充電式核酸分析儀(現場使用)進行檢測,檢驗預混試劑現場應用的效果。同時采用TRIzol法提取的這4份肉牛深部鼻腔棉拭子樣品的總RNA,將其與優化好的反應體系混勻后采用POCKITTM智能型核酸分析儀(實驗室使用)檢測,對比上述2種檢測方式的檢出率。

2 結果

2.1 重組質粒標準品的鑒定重組質粒經測序驗證為BPIV3,成功構建的BPIV3的陽性質粒濃度為96 mg/L,換算拷貝數為4.23×1010copies/μL,保存于-20℃備用。

2.2 優化后的反應體系經過篩選優化的iiRT-PCR反應體系: Taq酶(預混酶)25 μL,10 μmol/L的上、下游引物各3 μL,10 μmol/L的探針0.25 μL,20 U/μL的反轉錄酶2 μL,模板1 μL,使用DEPC H2O補足至50 μL。

2.3 特異性試驗結果通過使用本研究建立的iiRT-PCR方法對BPIV3的陽性cDNA和其他呼吸道病原核酸進行檢測,結果顯示:該方法只能特異性的檢出BPIV3,而不能檢出其他的牛呼吸道疾病相關病原(圖1),將檢測到的陽性產物進行測序,測序結果均為BPIV3,表明該方法的特異性較強。

2.4 靈敏性試驗結果本研究制備的BPIV3陽性質粒拷貝數為4.23×1010copies/μL,10倍遞增稀釋樣品,進行敏感性檢測,結果顯示建立的iiRT-PCR對BPIV3的檢測范圍是4.23×1010～4.23×100copies/μL,核酸最低檢測下限為4.23×100copies/μL(圖2)。

2.5 重復性試驗結果用建立的BPIV3 iiRT-PCR方法對3個稀釋度(4.23×104～4.23×106copies/μL)陽性標準品分別進行3次重復檢測,批間變異系數(Cv)為2.16%～2.58%,批內變異系數(Cv)為1.37%～1.73%,表明本試驗建立的BPIV3 iiRT-PCR方法重復性較好(表2)。

表2 iiRT-PCR方法的重復性試驗結果

2.6 iiRT-PCR的通用性評價用建立的BPIV3 iiRT-PCR方法對A基因型、B基因型和C基因型陽性質粒進行檢測,結果顯示本研究建立的BPIV3 iiRT-PCR方法對3種基因型都可檢出(圖3),表明建立的BPIV3 iiRT-PCR方法通用性較好。

A.BPIV3 A基因型陽性質粒;B.BPIV3 B基因型陽性質粒;C.BPIV3 C基因型陽性質粒;N.陰性對照

2.7 臨床樣本的檢測結果利用本研究建立的iiRT-PCR方法以及文獻報道的另外2種BPIV3的檢測方法對國內6個省份共191份呼吸道樣本中的BPIV3進行檢測,iiRT-PCR方法檢測結果顯示,141份肉牛鼻拭子樣本中檢出55份BPIV3陽性, 50份牦牛肺臟樣本中檢出22份BPIV3陽性,iiRT-PCR方法對BPIV3的檢出結果可以覆蓋另外2種方法的檢測結果,符合率為88.48%～94.76%(表3),說明建立的iiRT-PCR方法可以實現對臨床樣本的檢測。通過本研究建立的方法對6個省份樣本中BPIV3檢測結果顯示,內蒙古、河南、寧夏、山西、四川和福建6個省份的肉牛鼻腔棉拭子樣本檢測到BPIV3陽性,陽性率為20.00%～80.00%,場陽性率為50.00%～100.00%;在牦牛肺臟樣本中BPIV3的陽性率為44.00%(22/50),場陽性率為100.00%(5/5),表明BPIV3在我國上述的6個省份的肉牛和四川阿壩州地區的牦牛中均有存在(表4)。

表3 臨床樣品的檢測結果 %

表4 BPIV3在6個省份的流行情況

2.8 iiRT-PCR方法的現場應用驗證用預混試劑檢測BPIV3,結果顯示4份樣本中具有2份陽性和2份陰性,該檢測結果和TRIzol法提取核酸所進行的實驗室檢測方式結果一致,表明本研究建立的iiRT-PCR方法能夠滿足現場檢測的條件。

3 討論

BPIV3是牛呼吸道疾病的重要病原,感染BPIV3后造成牛的呼吸道損傷和免疫抑制[13],常繼發引起其他病原的感染,造成患畜臨床癥狀的相似,臨床診斷較難,所以往往需要使用實驗室診斷的方法進行確診[29]。目前,國內外已有多種BPIV3的PCR檢測方法[16,19,22,30],但仍未見能夠現場診斷BPIV3的PCR方法。眾所周知,病原的快速檢測和檢測方法的靈敏性對疾病的診斷具有重要影響,本研究通過對GenBank中102條P基因的對比后,選擇高度保守區域設計了特異性引物和探針,并通過對反應體系的優化,成功建立了特異性強、靈敏性高和重復性好的BPIV3 iiRT-PCR檢測方法,將優化好的反應體系預混凍干后,搭配現場核酸提取試劑盒POCKITTM系列核酸分析儀,從核酸提取到報告PCR結果僅需1 h,實現了BPIV3的現場檢測,為BPIV3的快速診斷提供了有利工具。

本研究分別采用建立的iiRT-PCR和另外2種TaqMan-MGB 熒光定量 RT-PCR方法對內蒙古、河南、寧夏、山西、四川和福建6個省191份BRDC樣本進行BPIV3的檢測后發現,所建立的iiRT-PCR方法對BPIV3的檢出率均高于其余2種檢測方法,分析發現,其中1個TaqMan-MGB 熒光定量 RT-PCR方法選取M基因作為檢測靶點進行引物和探針的設計,通過對比GenBank中已登錄的34條M基因發現,該方法的引物和探針只能完全匹配34條M基因序列中的9條,與中國已上傳至GenBank中的5條M基因全部不能完全匹配,這可能是導致該方法在本研究中檢測率低于其余2種方法的重要原因。同樣選取了P基因保守區域設計引物作為檢測靶點的TaqMan-MGB 熒光定量 RT-PCR方法,檢出率低于本研究建立的iiRT-PCR方法,可能是因為本研究所用方法有更低的核酸檢測下限(4.23 copies/μL),而報道的TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR方法檢測下限為100 copies/μL。

近年來,隨著我國養牛業的快速發展,肉牛貿易運輸愈發頻繁[31],BRDC已經成為了阻礙養牛業健康發展的主要疾病之一[4]。BPIV3是導致BRDC的重要病原,但國內關于BPIV3的分子流行病學調查資料仍尚不完整[10]。本研究通過建立的iiRT-PCR方法對6個省141份肉牛鼻腔棉拭子樣本進行檢測后發現,內蒙古、河南、寧夏、山西、四川和福建6個地區的樣本均有BPIV3的檢出,BPIV3平均陽性率為39.01%(55/141),平均場陽性率為76.92%(10/13),表明BPIV3已經在上述省份的養牛業中普遍存在,該結果豐富了國內BPIV3的分子流行病學調查資料。牦牛是我國青藏高原特有的經濟物種和當地人民不可或缺的生活物資,而呼吸道疾病常發生于牦牛群體中[32]。本研究對四川省紅原縣和若爾蓋縣采集的5個牧場的50份牦牛肺臟樣本進行BPIV3檢測后發現,BPIV3平均陽性率為44.00%(22/50),場陽性率為100.00%(5/5),該結果表明BPIV3已經廣泛流行于四川地區的牦牛群體中。因此,進一步加強牦牛群體內BPIV3的監測,對青藏高原地區牦牛BRDC的防控具有重要意義。

綜上所述,本研究建立的BPIV3的iiRT-PCR方法具有特異性強、穩定性好和靈敏性高特點,可用于BPIV3的快速檢測,為BPIV3的流行病學調查和現場診斷提供了新的方法。本研究結果豐富了國內BPIV3的分子流行病學資料,為牛呼吸道疾病的防控提供了參考。