A型塞內卡病毒VP2蛋白單抗制備及阻斷ELISA方法的建立

田占云,崔 川,李明珠,白若曼,安滿鑫,袁萬哲,李麗敏

(河北農業大學 動物醫學院,河北 保定 071000)

A型塞內卡病毒(Senecavirus A,SVA)又稱塞內卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)[1],是塞內卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)屬中的唯一成員[2]。SVA是一種單股正鏈RNA病毒,最初被認為是一種細胞培養基污染物,從被胎牛血清或豬胰蛋白酶污染的PER.C6細胞系中分離獲得[3]。該病毒主要感染豬,尤其是新生仔豬[4]。2002年在美國首次發現該病毒,2007年加拿大報道了首例SVA陽性病例[5],2015年是SVA流行病學轉折點,巴西多個省暴發SVA疫情[6-8],隨后,中國、泰國[9]、哥倫比亞[10]等多個國家出現SVA疫情,給養豬業造成巨大的經濟損失。2015年3月我國廣東[11]首次暴發SVA,之后河南省[12]、福建省[13]、山東省[14]、四川省[15]等地相繼暴發該病,SVA疫情的防控變得至關重要。該病的臨床癥狀與口蹄疫、特發性水皰病不容易區分,給診斷造成了一定難度,因此需要借助實驗室相關檢測技術進行確定。

酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)因其良好的敏感性、特異性、重復性和穩定性以及快捷、自動化程度高的優勢,被廣泛應用于臨床大批樣本的檢測。相比間接ELISA, 阻斷ELISA有特異性強、穩定性好、準確性高等優點,非常適用于SVA抗體臨床檢測?？贵w介導的體液免疫能有效清除血清中的病原,在抵御感染中發揮著關鍵性作用。豬只感染SVA后5 d左右體內就會出現中和抗體,到感染后第7天中和抗體水平達到峰值,隨著中和抗體水平的增加能有效緩解病毒引起的臨床癥狀,降低血清和組織內病毒滴度,并減少病毒的排放和傳播[16-18]。VP2抗原可能比VP1和VP3具有更強的免疫原性,MAGGIOLI等[19]證實VP2蛋白作為4種結構蛋白中氨基酸數目最多的蛋白具有SVA的主要中和表位,VP2蛋白產生的中和抗體在宿主控制SVA病毒血癥中發揮著關鍵作用。而且值得注意的是,針對VP2的特異性IgG抗體一直到感染后的第5周還能被檢測到,這相對于VP1、VP3蛋白是無法比擬的優勢。DVORAK等[20]證明VP2在ELISA 試驗上表現出較高的親和力,對陽性樣品與陰性樣品的鑒別能力更強。無論是在機體抵抗SVA感染研究,還是臨床疾病診斷和疫苗研發中,VP2都是不可忽略的關鍵性靶點[21]。

本研究制備SVA VP2單克隆抗體,以單克隆抗體為基礎建立檢測SVA特異性抗體的阻斷ELISA方法,為SVA監測和防控提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 細胞及重組蛋白pET32a(+)-SVA VP2、BHK-21細胞由本實驗室保存;SP2/0骨髓瘤細胞由河北農業大學傳染病實驗室提供。

1.2 主要試劑Montanide IMS 251C VG佐劑為SEPPIC公司產品;辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG、DAB顯色液購于北京中杉金橋生物技術有限公司;HAT選擇培養基、HT 選擇培養基購于Sigma公司;1640培養基、DMEM培養基、胎牛血清購自Gibco公司;TMB顯色液購自北京索萊寶科技有限公司;臨床豬血清由河北農業大學動物醫學院衛檢實驗室提供。

1.3 McAb的制備及特性鑒定用重組SVA VP2蛋白[21]免疫6～8周齡的BALB/c小鼠,通過頸背部多點皮下注射200 μL(50 μg)抗原,14 d后,以相同劑量,通過相同免疫途徑進行第2次免疫,二免后14 d進行第3次免疫,腹腔注射同等劑量VP2蛋白,融合前3 d,直接腹腔注射100 μg VP2蛋白。將獲得的免疫脾細胞與SP2/0細胞融合,利用選擇性培養基篩選陽性細胞,并對其進行亞克隆。經過多輪亞克隆篩選出穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株,采用體內誘生腹水法制備SVA VP2蛋白的單克隆抗體,并對單克隆抗體的效價、亞型以及免疫反應性進行鑒定。

1.4 McAb酶標及質量檢測使用戊二醛交聯改良二步法對單克隆抗體進行過氧化物酶標記。對制備的酶標抗體進行質量檢測,包括酶量、IgG 含量、酶與IgG物質的量的比值及結合率的測定。酶量(g/L)=D403 nm×0.42;IgG量(g/L)=(D280 nm-D403 nm×0.42)×0.94×0.62。辣根過氧化物酶和IgG的相對分子質量分別為40 000和160 000,根據相對分子質量換算摩爾質量并計算酶與IgG物質的量的比值。酶結合率=結合物中的酶量/標記時加入的酶量×100%。

1.5 阻斷ELISA反應條件的優化通過棋盤法確定重組VP2蛋白包被質量濃度和McAb的使用濃度。使用直接ELISA法:將純化好的重組VP2蛋白分別稀釋為1.5,2,3,4,6,8,12 mg/L,包被酶標板,每孔100 μL,4℃包被12 h;PBST洗3次,每次3 min,拍干;按照200 μL/孔加含5%胎牛血清的PBST于37℃封閉1 h;同上洗滌,將酶標抗體按400,800,1 600,3 200,6 400,12 800倍比稀釋后按100 μL/孔加入酶標板中,37℃溫育1 h;按照100 μL/孔加入單組份TMB顯色液,37℃避光反應10 min;之后每孔加入100 μL 2 mol/L H2SO4終止顯色,讀取D450 nm值。取D450 nm值為1左右的可作為抗原包被質量濃度和酶標抗體稀釋倍數的最佳組合。

使用以上確定的最佳條件,分別用5%胎牛血清、5%脫脂奶粉、1% BSA和2% BSA進行封閉,取陽性血清和陰性血清,按照1∶1,1∶2,1∶4,1∶8的稀釋度稀釋后檢測,顯色時間設置為5,10,15 min,比較陰陽性血清抑制率,確定最佳反應條件。

1.7 阻斷ELISA特異性及敏感性試驗使用優化后的阻斷ELISA方法檢測豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、SVA抗體陽性豬血清,判定其是否與其他病毒發生交叉反應。

將SVA陽性血清做1∶10,1∶20,1∶40,1∶80,1∶160,1∶320,1∶640倍比稀釋,用建立的阻斷ELISA方法檢測,確定能檢測出高于臨界值的血清最高稀釋度,然后測血清最高稀釋倍數中總蛋白含量,判斷其敏感性。

1.8 阻斷ELISA重復性試驗批內重復試驗:用同一批次蛋白包被的酶標板按照建立的阻斷ELISA條件對10份豬血清樣品重復3次檢測,測定D450 nm值,并計算抑制率。

批間重復試驗:用3個批次蛋白包被的酶標板按照建立的阻斷ELISA條件對10份豬血清樣品進行檢測,測定D450 nm值,并計算抑制率。

1.9 臨床血清樣品的檢測利用建立的阻斷ELISA方法和間接免疫熒光(IFA)方法同時對91份臨床血清樣品進行檢測,計算陽性率和陰性率的符合率,評價本研究所建立方法的效果。使用建立的阻斷ELISA方法對河北省部分地區372份豬血清樣品進行檢測,并分析SVA的流行情況。

2 結果

2.1 McAb的鑒定將制備的2株雜交瘤細胞培養上清和相應的腹水進行稀釋,如圖1所示,應用間接ELISA方法測得 1E9、2D4 兩株雜交瘤細胞培養上清效價分別為1∶1 280,1∶5 120。1E9、2D4 腹水效價分別為1∶1 000×56和1∶1 000×55。

圖1 2株單抗雜交瘤上清效價檢測結果

2株雜交瘤細胞的培養上清分別與抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM抗體進行反應,結果如圖2所示,2株抗體均與抗IgG1 抗體發生反應,表明1E9、2D4雜交瘤細胞分泌的抗體均為IgG1類。

圖2 單抗亞類類型鑒定

分別將單抗1E9、2D4與SVA VP2蛋白反應,Western blot結果如圖3所示,在50 kDa處出現清晰的特異性條帶,說明2株單克隆抗體均能夠與VP2蛋白發生特異結合。

M.Blue Plus蛋白Marker;1.1E9;2.2D4

2.2 酶標二抗質量檢測將純化后的2D4單抗進行過氧化物酶標記,酶標后產物測得D280 nm為4.529,D403 nm為2.15,酶結合量為0.84 g/L,酶/IgG物質的量的比為1.57,酶結合率約8.4%。如圖4,根據與酶標抗體的各項指標參數比較,綜合評判此次酶標抗體質量較好,可以用于 ELISA試驗。

圖4 酶標抗體結果評價

2.3 阻斷ELISA反應條件的優化通過棋盤法使用直接ELISA檢測,結果如表1所示,在使用4 mg/L 的包被質量濃度,酶標單抗稀釋3 200倍時D450 nm值為1左右,所以以此組合作為ELISA方法中的反應條件。

表1 抗原包被質量濃度和酶標抗體稀釋倍數方陣與結果 D450 nm值

根據已確定的VP2蛋白和酶標單抗的最佳工作濃度,按ELISA程序先后只改變血清稀釋倍數、封閉液、顯色時間中的1個條件,通過比較最大抑制率,結果如表2,得到血清的最佳稀釋倍數1∶4,1% BSA封閉效果最佳、TMB避光顯色10 min效果最好。

表2 阻斷ELISA條件優化結果

表3 阻斷ELISA檢測40份陰性血清結果

2.5 特異性及靈敏性檢測如圖5顯示,用建立的阻斷ELISA方法檢測 PEDV、PRV、PRRSV抗體陽性血清,抑制率均<30%,表明建立的阻斷ELISA方法與其他病毒血清不發生交叉反應,具有良好的特異性。

圖5 SVA阻斷ELISA特異性試驗

取已知蛋白濃度SVA抗體陽性血清和陰性血清做倍比稀釋,進行靈敏性檢測。當1∶160倍稀釋時(此稀釋倍數下血清中總蛋白質量濃度為0.03 g/L)抑制率<30%,表明建立的阻斷ELISA方法最低可以檢測到3 μg血清蛋白,靈敏度較高。

2.6 重復性檢測使用10個血清樣品重復檢測3次,再分別包被3個批次蛋白檢測3次,如表4,5顯示,批內、批間重復試驗變異系數均控制在6%以內,符合要求,表明該方法穩定性良好。

表4 10份血清批內重復結果

表5 10份血清批間重復結果

2.7 臨床血清樣品的符合率檢測及應用對91份豬血清進行檢測,IFA共檢測出8份陽性樣品,阻斷ELISA檢測出10份陽性樣品,經計算,陽性檢出率分別為8.8%(8/91)和11.0%(10/91),陽性符合率為80% (8/10),陰性符合率為97.6% (81/83),總符合率為97.8% (89/91),表明阻斷ELISA方法的檢測效果較好。

共檢測了河北部分地區的372份樣品,陽性率為7.8%(29/372),如圖6其中保定地區陽性率最高可達16.4%(12/73),邯鄲地區14.1%(11/78),滄州地區5.9%(4/68),石家莊地區4.2%(1/24),張家口地區3.0%(1/33),承德地區1.4%(1/71),在邢臺(0/15)、衡水地區(0/10)未有陽性檢出。在春夏兩季發病率比較高,分別為10.9%(6/55)和8.3%(19/227),秋冬兩季的檢出率分別為5.4%(4/7)和0.0%(0/16)。

圖6 河北部分地區SVA抗體陽性率

3 討論

目前已建立了多種診斷SVA感染的方法,如聚合酶鏈式反應(PCR)[24-26]、反轉錄環介導等溫擴增(RT-LAMP)[27-28]、病毒分離培養、病毒中和試驗(VNT)[23,29]、間接免疫熒光試驗(IFA)[30]、ELISA[23,31]等。有兩種主要的診斷方法:競爭ELISA法[32]和各種RT-PCR法[33-40],其中一些方法已被用于臨床檢測[23,33]。YANG等[41]制備了SVA的單克隆抗體,并利用該抗體建立了競爭性ELISA方法,通過試驗證實該方法與中和試驗和間接免疫熒光檢測結果具有較強的符合度,表明該檢測方法適用于SVA血清學檢測。目前,滅活病毒和單體蛋白是ELISA程序中檢測血清抗體的常用包被抗原。然而,使用完整的病毒作為抗原會帶來安全風險,而單體蛋白或多肽的免疫原性相對較差。因此,選擇一種既安全又具有高度免疫原性的重組蛋白作為診斷抗原,對新診斷技術的發展至關重要。本研究中使用的包被抗原為原核表達的可溶性VP2,相對于包涵體蛋白在空間結構上更接近于天然蛋白。孫培培等[42]利用VP2單克隆抗體建立了檢測SVA的阻斷ELISA方法,但其與VNT試驗的符合率較低。本研究所建立的阻斷ELISA方法與間接ELISA方法的總符合率為97.8%。申珊等[38]建立的檢測SVA阻斷ELISA方法,與VNT試驗檢測的符合率為96%,有較高的準確性,但操作過程需加血清樣品、單克隆抗體、酶標二抗3個步驟,操作較為繁瑣,而本研究將單克隆抗體與酶標記結合,減少了酶標二抗加入這一步驟,在操作上比申珊等[43]建立的方法更為簡潔、方便。

阻斷ELISA檢測方法的優劣與酶標抗體的質量有密切的關系,本試驗使用戊二醛作為交聯劑與過氧化物酶進行交聯,制備酶標抗體,該方法能將過氧化物酶與抗體通過五碳橋的方式進行連接,酶標產物結合穩固且效率較高。本次制備的HRP酶標抗體在酶量、酶結合率、酶標記率等指標上都表現良好,可適用于ELISA和Western blot。在阻斷ELISA方法建立過程中分步優化了各種影響因素,且從結果上分析,這些因素對結果的影響不大。河北部分地區的血清樣品的檢測結果顯示,SVA在河北省的分布較廣,SVA 很可能在河北省內傳播時間較長,需切實加強檢疫監管,做好疫情的處置,開展回溯性研究和主動監測等工作刻不容緩。