布魯菌二聯(lián)BCSP31-L7/L12-IL-2嵌合病毒樣顆粒疫苗候選株的構(gòu)建與鑒定

鄒映雪,黃天鴻,馮嘉軒,丁佳欣,陳銘樺,陳凱楠,郭春紅,張 頔,丁 壯

(吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實驗室,吉林 長春130062)

布魯菌病是由布魯菌所引起一種慢性、持續(xù)性感染的人畜共患傳染病[1]。該病自首次被證實以來在世界范圍內(nèi)廣泛存在。目前已知可感染布魯菌的動物達(dá)60余種,豬、牛、羊為主要傳染源。 該病可引起母畜流產(chǎn)、死胎,人睪丸炎及生殖系統(tǒng)損傷等癥狀,被世界衛(wèi)生組織認(rèn)為是七大被忽視的人畜共患病之一[2]。因此,通過疫苗的接種對于控制并最終消除這種疾病至關(guān)重要。目前,布魯菌病常用的傳統(tǒng)疫苗主要為Rev-1、S19及S2等減毒活苗,但上述活苗存在副作用較強(qiáng)、種屬局限性較大、接種后干擾血清學(xué)診斷及可能出現(xiàn)毒力返強(qiáng)等缺點(diǎn)[3]。由此,針對傳統(tǒng)疫苗免疫種屬局限性、保護(hù)局限性以及單一抗原組分無法引起有效細(xì)胞免疫應(yīng)答,保護(hù)效果相對有限的特點(diǎn),研發(fā)一種綠色、安全、高效、“一針多防”、可實現(xiàn)多方位免疫且在各菌種間高度保守的布魯菌新型疫苗——布魯菌嵌合病毒樣顆粒,對布魯菌病的防控可發(fā)揮重要作用。L7/L12蛋白廣泛存在于各個種的布魯菌中,在各種間高度保守,是布魯菌優(yōu)勢抗原蛋白之一[4]。BCSP31基因在布魯菌中均可表達(dá)(除了綿羊附睪布魯菌外),可刺激機(jī)體對布魯菌感染產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答,上述2種蛋白可以作為開發(fā)疫苗的候選抗原[5]。IL-2又名T細(xì)胞生長因子(T cell growth factor,TCRF),具有促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖分化,誘導(dǎo)干擾素(interferon,IFN)與腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等細(xì)胞因子的分泌[6],增強(qiáng)機(jī)體免疫力,充當(dāng)佐劑增強(qiáng)疫苗保護(hù)力、降低疫苗副作用等功能,可作為增強(qiáng)新型疫苗保護(hù)效力的候選免疫增強(qiáng)因子。

病毒樣顆粒(VLPs)是由病毒的一種或幾種結(jié)構(gòu)蛋白自行組裝而成的顆粒,具有與病毒顆粒類似的空間結(jié)構(gòu)[7]。與傳統(tǒng)疫苗相比,VLPs不含病毒核酸,不能進(jìn)行自主復(fù)制,具有極高的安全性,還可通過MHCⅠ和MHCⅡ交叉提呈方式增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞的攝取、加工和提呈能力,并通過與病毒粒子相同的途徑誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的天然性免疫與獲得性免疫反應(yīng)[8]。近些年來,VLPs技術(shù)的應(yīng)用逐漸廣泛,以VLPs為載體研發(fā)疫苗也已成為新的方向。VLPs疫苗作為一種新型疫苗,因其綠色安全的特性及其具有強(qiáng)大的免疫優(yōu)勢,為基因工程疫苗的研究提出了很好的方向,這種綠色生態(tài)、安全高效的非全病原疫苗或新型疫苗也已成現(xiàn)在和未來的疫苗研發(fā)主流[9]。

因此,本研究基于實驗室已成功構(gòu)建的昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),以實驗室保留的基因Ⅶ型NA-1株M的ND VLPs為基礎(chǔ),分別通過GPI錨定策略將IL-2、布魯菌病保護(hù)性抗原蛋白L7/L12、BCSP31引入該VLPs,構(gòu)建表達(dá)布魯菌L7/L12、BCSP31蛋白的二聯(lián)嵌合型布魯菌VLPs,彌補(bǔ)目前使用傳統(tǒng)疫苗不足,以期為布魯菌病的防制提供新策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒及載體EscherichiacoliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞、Sf9昆蟲細(xì)胞均為本實驗室保存;EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;rBv-M,rBv-BCSP31,pFastBac1-GPI空載體為本實驗室保存。

1.2 主要試劑2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix購自北京聚合美生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自Axygen公司;T4連接酶購自全式金公司;胎牛血清購自BI公司;昆蟲培養(yǎng)基Sf-900TMⅢ SFM (1×)購自Gibco公司;X-treme GENEHP DNA Transfection Reagent購自ROCHE公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計根據(jù)GenBank中IL-2(鼠IL-2序列,GenBank:NM-008366.3)、布魯菌S2型L7/L12(ANH46869)序列分別設(shè)計IL-2-F、IL-2-R、L7/L12-F、L7/L12-R鑒定引物以及pFastBac1-GPI通用引物送至上海生物公司合成,序列信息見表1。

表1 引物信息

1.4 目的基因的合成根據(jù)GenBank中IL-2(鼠IL-2序列,GenBank:NM-008366.3)、布魯菌S2型L7/L12(ANH46869)序列,分別在上游添加SalⅠ酶切位點(diǎn),下游添加KpnⅠ酶切位點(diǎn),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并克隆至pUC57載體,分別命名為pUC57-L7/L12、pUC57-IL-2。

1.5 分別表達(dá)L7/L12、IL-2基因的重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定將實驗室保存pFastBac1-GPI空載體及公司合成pUC57-L7/L12、pUC57-IL-2分別用SalⅠ、KpnⅠ進(jìn)行雙酶切,通過1%核酸電泳鑒定正確后,分別膠回收產(chǎn)物。使用T4連接酶將pFastBac1-GPI線性載體分別與L7/L12、IL-2連接后轉(zhuǎn)化至EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。次日挑取單菌落分別使用其特異性引物進(jìn)行PCR鑒定,取鑒定正確的菌株接種至LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。利用SalⅠ、KpnⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定正確后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,將鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒分別命名為pFastBac1-GPI-L7/L12、pFastBac1-GPI-IL-2。

1.6 分別表達(dá)L7/L12、IL-2基因的重組桿粒的構(gòu)建及鑒定將pFastBac1-GPI-L7/L12、pFastBac1-GPI-IL-2分別轉(zhuǎn)化至EscherichiacoliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,次日挑取單菌落分別使用特異性引物及M13引物進(jìn)行PCR鑒定,特異性引物及M13引物均鑒定為陽性的菌液再次在3抗固體培養(yǎng)基上進(jìn)行第2次劃線篩選。重復(fù)上述菌落劃線和菌液PCR,將連續(xù)3次篩選正確的菌液視為陽性菌液。提取桿粒,將鑒定正確的桿粒命名為rBacmid-GPI-L7/L12、rBacmid-GPI-IL-2。

1.7 分別表達(dá)L7/L12、IL-2基因的重組桿狀病毒的拯救與鑒定用3.5 cm細(xì)胞培養(yǎng)板接種Sf9細(xì)胞,待其生長密度為80%～85%時分別將rBacmid-GPI-L7/L12、rBacmid-GPI-IL-2與轉(zhuǎn)染試劑按照1∶3的比例混合均勻并靜置15 min后接種細(xì)胞,27℃培養(yǎng)96 h,收集上清為P1代。將P1代接入到培養(yǎng)密度為80%～85%且狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞中,27℃培養(yǎng)96 h,再次收集上清視為P2代。盲傳4代后,收集P4代桿狀病毒,提取基因組,分別用特異性引物及通用引物進(jìn)行PCR鑒定,將結(jié)果正確的樣品命名為rBv-L7/L12、rBv-IL-2。

1.8 分別表達(dá)L7/L12、IL-2基因的重組桿狀病毒滴度的測定使用桿狀病毒滴度快速測定試劑盒測定病毒滴度,具體操作見說明書。

1.9 IFA檢測將rBv-L7/L12、rBv-IL-2及實驗室保留的rBv-M、rBv-BCSP31以MOI=5共感染培養(yǎng)密度為80%～85%且狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞,同時設(shè)置未感染組作對照,培養(yǎng)48 h后,用4%多聚甲醛溶液將細(xì)胞于4℃固定10 min,再使用Triton-100室溫通透10 min,分別以L7/L12、IL-2、NDV M及BCSP31的多克隆抗體為一抗,4℃過夜孵育后,用FITC標(biāo)記的豬抗兔IgG抗體作為二抗室溫孵育1 h,用DAPI于室溫下染核10 min,利用倒置熒光顯微鏡觀察各組分蛋白的表達(dá)。

1.10 BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs的制備與鑒定

1.10.1BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs的制備 將構(gòu)建成功的P4代rBv-L7/L12、rBv-IL-2與實驗室保存的rBv-M、rBv-BCSP31以MOI=5共感染懸浮培養(yǎng)密度為2×106個/mL的Sf9細(xì)胞,27℃、200 r/min 轉(zhuǎn)動培養(yǎng)96 h后收集細(xì)胞懸液,分別經(jīng)過20%,30%,60%蔗糖,100 000 ×g離心2 h后獲得純化BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs。

1.10.2BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs的鑒定 以L7/L12、IL-2、NDV M及BCSP31的多克隆抗體為一抗,對純化后獲得的BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs進(jìn)行Western blot鑒定,利用透射電鏡觀察其形態(tài)特征。

2 結(jié)果

2.1 重組穿梭質(zhì)粒pFastBac1-GPI-L7/L12、pFastBac1-GPI-IL-2的鑒定利用SalⅠ、KpnⅠ對pFastBac1-GPI-L7/L12、pFastBack1-GPI-IL-2進(jìn)行雙酶切鑒定,將產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,可見pFastBac1-GPI-L7/L12酶切后產(chǎn)生大小為375,4 936 bp的2條條帶,pFastBack1-GPI-IL-2酶切后產(chǎn)生大小為510,4 963 bp的2條條帶,與預(yù)期大小相符(圖1),測序結(jié)果顯示無突變。

M.DL5000 DNA Marker;1.pFastBac1-GPI-L7/L12雙酶切;2.pFastBac1-GPI-IL-2雙酶切

2.2 重組桿粒rBacmid-GPI-L7/L12、rBacmid-GPI-IL-2的鑒定3次藍(lán)白斑篩選后,將鑒定正確的菌液接菌擴(kuò)大培養(yǎng)后提取桿粒,分別使用特異性引物及M13通用引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,L7/L12特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小為375 bp,IL-2特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小為375 bp,M13通用引物擴(kuò)增rBacmid-GPI-L7/L12獲得片段大小為2 875 bp,M13通用引物擴(kuò)增rBacmid-GPI-IL-2獲得片段大小為3 010 bp(圖2)。

A.特異性引物PCR擴(kuò)增rBacmid-GPI-L7/L12結(jié)果(M1.DL2000 DNA Marker;1.PCR產(chǎn)物 );B.通用引物PCR擴(kuò)增rBacmid-GPI-L7/L12產(chǎn)物(M2.DL5000 DNA Marker;2.PCR產(chǎn)物);C.特異性引物PCR擴(kuò)增rBacmid-GPI-IL-2產(chǎn)物(M1.DL2000 DNA Marker;3.PCR產(chǎn)物);D.通用引物PCR擴(kuò)增rBacmid-GPI-IL-2產(chǎn)物(M2.DL5000 DNA Marker;4.PCR產(chǎn)物)

2.3 重組桿狀病毒rBv-L7/L12、rBv-IL-2的鑒定

2.3.1Sf9細(xì)胞病變觀察 將桿粒rBacmid-GPI-L7/L12、rBacmid-GPI-IL-2轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞,用光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),與正常Sf9細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長緩慢,細(xì)胞變大、變圓、呈顆粒變性狀,且有細(xì)胞產(chǎn)生脫落、破碎等典型病變(圖3)。

1.正常Sf9細(xì)胞;B.rBv-L7/L12感染后細(xì)胞;C.rBv-IL-2感染后細(xì)胞

2.3.2重組桿狀病毒rBv-L7/L12、rBv-IL-2的鑒定 將桿粒rBacmid-GPI-L7/L12、rBacmid-GPI-IL-2轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞,收集上清盲傳4代,提取P4代桿狀病毒的基因組,用特異性引物以及M13通用引物進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果顯示,擴(kuò)增條帶大小與預(yù)期相符(圖4)。

A.特異性引物PCR擴(kuò)增rBacmid-GPI-L7/L12結(jié)果(M1.DL2000 DNA Marker;1.PCR產(chǎn)物 );B.通用引物PCR擴(kuò)增rBacmid-GPI-L7/L12產(chǎn)物(M2.DL5000 DNA Marker;2.PCR產(chǎn)物);C.特異性引物PCR擴(kuò)增rBacmid-GPI-IL-2產(chǎn)物(M1.DL2000 DNA Marker;3.PCR產(chǎn)物);D.通用引物PCR擴(kuò)增rBacmid-GPI-IL-2產(chǎn)物(M2.DL5000 DNA Marker;4.PCR產(chǎn)物)

2.3.3IFA檢測 利用激光共聚焦顯微鏡觀察cVLPs的各組分蛋白表達(dá)情況,可見各試驗組與未感染組相比均出現(xiàn)綠色熒光信號,表明各組分蛋白均正確表達(dá)(圖5)。

圖5 IFA檢測各蛋白表達(dá)(×200)

2.4 BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs的鑒定

2.4.1BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs的透射電鏡觀察 透射電鏡觀察純化后的cVLPs形態(tài),粒子呈球形,大小約為100 nm,表面存在纖突結(jié)構(gòu),與野生型NDV粒子相似(圖6)。

A.野生NDV NA-1株;B.BCSP31-L7/L12-IL-2

2.4.2BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs Western blot分析 將經(jīng)過純化的BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs 進(jìn)行Western blot 鑒定,結(jié)果顯示可分別與NDV M、BCSP31、L7/L12及IL-2多克隆抗體結(jié)合且條帶與預(yù)期的大小相符,NDV M、L7/L12、IL-2、BCSP31蛋白大小分別為 40,20,25,36 kDa(圖7)。

M.蛋白Marker;A.BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs M蛋白;B.BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs L7/L12蛋白;C.BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs IL-2蛋白;D.BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs BCSP31蛋白

3 討論

理想的布魯菌疫苗應(yīng)具有下述特點(diǎn)[10]:(1)不會產(chǎn)生干擾血清學(xué)診斷的抗體;(2) 能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的Th1型免疫反應(yīng);(3)具有穩(wěn)定性、易生產(chǎn)和便于操作特點(diǎn);(4)毒性減弱且可使免疫動物感染,但對人不能有致病性;(5) 能夠?qū)θ焉飫游锂a(chǎn)生長期保護(hù)效果且不會使其發(fā)生空懷、流產(chǎn)、死胎等癥狀;(6)再次免疫時不會出現(xiàn)血清轉(zhuǎn)換。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所聯(lián)合蘭州獸醫(yī)研究所等單位以傳統(tǒng)M5-90疫苗為基礎(chǔ)研發(fā)了可區(qū)分自然感染與野毒感染的bp26基因缺失標(biāo)記活疫苗產(chǎn)品,但現(xiàn)有常用布魯菌傳統(tǒng)疫苗仍主要是減毒活疫苗,在免疫時存在諸多不足。首先:現(xiàn)常用疫苗A19、S2等是將篩選出的布魯菌菌株連續(xù)傳代致弱獲得的減毒活疫苗,但這種弱毒株制得的活苗仍具有殘余毒力,在免疫過程中可能具有危險性,出現(xiàn)感染人或免疫動物患病的問題;第二,連續(xù)傳代致弱獲得毒株作為疫苗在免疫中易出現(xiàn)毒力返強(qiáng)的問題;第三,現(xiàn)有常用布魯菌疫苗株在免疫后會刺激機(jī)體產(chǎn)生陽性血清[11],引起機(jī)體血清中的抗體持續(xù)性存在,導(dǎo)致無法區(qū)分疫苗感染與野毒感染,進(jìn)而干擾血清學(xué)診斷,對布魯菌病的確診造成了不良的影響,不利于流行病學(xué)調(diào)查,更不利于種畜布病凈化;第四,在我國所用的布病疫苗中,使用的菌株在連續(xù)傳代致弱后仍有毒力,例如M5是目前我國使用布魯菌疫苗中毒力最強(qiáng)的菌株,這導(dǎo)致在免疫過程中,可能會引起免疫動物流產(chǎn)乃至不孕[12];第五,現(xiàn)常用傳統(tǒng)疫苗如羊種Rev-1疫苗菌株分離自羊,主要用來預(yù)防羊的布魯菌病,牛種S19疫苗菌株分離自牛,被廣泛用于預(yù)防牛的布魯菌病,尚未存在各種屬間通用的布魯菌疫苗。由此,研發(fā)一種綠色、安全、高效、“一針多防”、可實現(xiàn)多方位免疫且在各菌種間高度保守的布魯菌新型疫苗——布魯菌嵌合VLPs,對布魯菌病的防制起著重要作用。

L7/L12蛋白為布魯菌核糖體蛋白,因其保守性高以及可引起機(jī)體產(chǎn)生良好免疫原性[13],常被應(yīng)用于制作布魯菌亞單位疫苗中。目前已有研究表示,該蛋白不僅可促使機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫,同時還可促進(jìn)Ⅱ型干擾素的轉(zhuǎn)錄與表達(dá),發(fā)揮吞噬巨噬細(xì)胞中細(xì)菌的功能[14]。BCSP31蛋白作為布魯菌表面蛋白,在除綿羊附睪布魯菌外,其他菌種中均可高度保守表達(dá),同源性高達(dá)99.3%[15],且現(xiàn)有研究表明,BCSP31蛋白作為布魯菌保護(hù)性抗原,可引起機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答,已有多種研究將其作為研發(fā)亞單位疫苗或開發(fā)新型疫苗的候選抗原[16-17]。因此,與布魯菌傳統(tǒng)疫苗相比,以ND VLPs為基礎(chǔ),上述2種蛋白為候選抗原研發(fā)的BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs可以打破諸多布魯菌傳統(tǒng)疫苗局限性問題。首先,VLPs與納米級病毒大小相似,是一種納米級顆粒,擁有多種疫苗給藥方式,可以通過皮下注射及肌肉注射給藥[18],也可以從灌服和滴鼻等方式通過黏膜部位免疫;第二,與全病原疫苗相比,VLPs具有與病毒顆粒類似的空間結(jié)構(gòu),可以保護(hù)自身天然結(jié)構(gòu)不被降解,可作為外源性抗原被樹突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞攝取,交由MHCⅡ類分子進(jìn)行抗原處理和提呈,刺激CD4+T輔助細(xì)胞。也可以作為內(nèi)源性抗原潛伏在樹突狀細(xì)胞胞漿中,由MHCⅡ類分子進(jìn)行抗原處理和提呈,從而刺激CD8+T輔助細(xì)胞[19],這種機(jī)制確保了機(jī)體能夠產(chǎn)生全面且有效的免疫反應(yīng);第三,與傳統(tǒng)弱毒疫苗相比,VLPs不含核酸,無法進(jìn)行自我復(fù)制[20],不會出現(xiàn)毒力返強(qiáng)、持續(xù)性帶毒、向外界排毒的現(xiàn)象,杜絕出現(xiàn)感染人或免疫動物患病的問題,不僅是一種高效的疫苗,還是一種安全、綠色、環(huán)保的疫苗;第四,VLPs通過引入保護(hù)性抗原構(gòu)建,不使用全病原,可通過建立針對cVLPs不含有的血清學(xué)診斷性抗原開發(fā)ELISA檢測方法,從而區(qū)分野毒感染抗體和cVLPs疫苗免疫抗體。

本研究成功構(gòu)建了在各菌種間高度保守且綠色、安全、高效、可實現(xiàn)多方位免疫的BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs,為布魯菌新型疫苗的研發(fā)提供了新思路。但本研究構(gòu)建的二聯(lián)嵌合VLPs疫苗免疫原性、免疫效果以及引入的IL-2 是否會起到增強(qiáng)免疫效果的作用仍有待進(jìn)一步研究。