CEF來源NDV Ex通過影響IFN-α、IFN-β、IL-1β、IL-6與iNOS促進NDV體內增殖

黃天鴻,鄒映雪,馮嘉軒,李金斗,丁佳欣,張 頔,于喜冰,陳銘樺,丁 壯

(吉林大學 動物醫學學院 人獸共患病研究教育部重點實驗室,吉林 長春 130062)

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(NDV)引起禽的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病,臨床上以高熱、呼吸困難、下痢、神經紊亂、黏膜和漿膜出血為特征。該病對易感家禽的致死率高達100%,給世界養禽業和貿易往來帶來了嚴重的經濟損失。NDV只有1種血清型,存在多種基因型。病毒基因組編碼6種結構蛋白(NP、P、M、F、HN和L蛋白)和2種非結構蛋白(V、W蛋白)。NDV基因組較小,不能編碼病毒復制所需的所有蛋白,在宿主體內進行高效復制和感染通常需要與宿主進行緊密的相互作用,并利用宿主蛋白實現自身的復制[1]。近年來有研究表明,外泌體(exosome,Exo)及其組分與病毒感染以及免疫反應有著密切的聯系。因此,外泌體在病毒感染過程中的作用研究對病毒的防制有著十分重要的意義。

外泌體是一類由細胞主動分泌釋放到胞外的小囊泡,直徑30～150 nm[2]。它在細胞間的蛋白、核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)和脂類等生物活性物質的傳遞與細胞間通訊中發揮著關鍵作用。越來越多的研究表明外泌體與體內病毒感染以及宿主抗病毒免疫反應關系密切,有些病毒甚至可以通過外泌體攜帶感染性病毒粒子或病毒組分在病毒感染進程中發揮作用[3]。HCV感染的人肝癌細胞外泌體含有病毒基因組及病毒蛋白,被證明具有傳染性,是該病毒在細胞間傳播的主要途徑[4]。含有病毒抗原的外泌體在與受體結合后,可在表面誘導信號級聯,以控制細胞的免疫應答。前期體外試驗發現,NDV刺激雞胚成纖維細胞(CEF)產生的外泌體(NDV Ex)無感染性,但可以影響病毒在多種體外培養的細胞系中的感染與復制,具有促進NDV增殖的作用[5-6],但在動物體內NDV Ex對NDV感染的作用卻并不清楚。成纖維細胞是雞體內中最常見且功能活動旺盛的細胞[7],本實驗室已經建立并完善了CEF源NDV Ex的大量提取純化方法。

本研究以易感NDV的SPF雛雞為研究對象,將熒光染色后NDV Ex經翅下靜脈注射SPF雛雞,通過體內成像研究NDV Ex的主要蓄積組織器官;將主要蓄積組織器官研磨提取RNA后,qPCR檢測肺臟、脾臟、肝臟病毒載量變化與Ⅰ型干擾素表達量的變化;分離肺泡巨噬細胞后通過流式細胞術及熒光定量檢測細胞吞噬能力及IL-6、IL-1β、iNOS變化。試驗結果表明CEF來源NDV Ex在機體內通過影響IFN-α、IFN-β、IL-1β、IL-6與iNOS的表達量來促進NDV增殖,為豐富外泌體相關的病毒感染機理以及NDV感染機制的理解與ND防控策略打下基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒、動物及主要試劑NDV強毒NA-1株(GenBank:DQ659677)由本實驗室分離保存;紅細胞裂解液購自北京全式金生物技術有限公司;雞淋巴細胞分離液購自深圳達科為公司;DiR熒光染料購自德國Merck公司;胎牛血清購自BI公司;FITC-dextran購自美國Ebioscience公司;外泌體洗脫柱購自美國Invitrogen公司;protein A/G磁珠購自MCE公司;小動物活體成像系統購自美國Kodak公司;CD63抗體由本實驗室分離保存;鼠TSG101抗體、PE標記的鼠抗雞MHC Ⅱ抗體購自Abcam公司;AF488標記的鼠抗雞Monocyte/Macrophage Marker (KUL01)單克隆抗體購自Abcam公司;7日齡SPF雞購自哈爾濱獸醫研究所。所有動物試驗均按照吉林大學動物福利研究倫理委員會批準的實驗操作規范操作(批準文號:2017060815-2)。

1.2 細胞培養與外泌體的分離鑒定解剖9日齡SPF雞胚獲取CEF,將細胞培養于含10% FBS DMEM的75 cm2培養瓶中,待細胞覆蓋率達到90%時,用PBS沖洗3遍,換為不含FBS的DMEM,加入NA-1(MOI=0.5)后3 h棄去培養基,用PBS沖洗3遍,再次加入無FBS DMEM以除去未感染細胞的細胞外病毒顆粒,48 h后收取上清,使用0.22 μm濾器過濾,100 000 ×g4℃離心1 h。使用實驗室前期建立的外泌體純化方法除去病毒顆粒[8],將產物與雞CD63抗體在室溫下靜置孵育30 min。將混合物與protein A/G磁珠在旋轉條件下溫育30 min。用PBS洗滌磁珠3次后用洗脫緩沖液(150 mol/L甘氨酸,pH2.7)洗脫,用中和緩沖液中和后儲存于-80℃備用,使用Western blot和電子顯微鏡進行鑒定。

1.3 外泌體熒光染色制備熒光標記外泌體需全程避光。將制備好的外泌體從-80℃冰箱取出,用DiR熒光染料以1∶100體積比加入外泌體,放入37℃搖床1 h,使其染色充分。利用外泌體洗脫柱,800×g室溫離心3 min,收集離心后液體,鋁箔紙包裹,避光保存[9]。

1.4 外泌體體內分布檢測將經熒光染色后的200 μg NDV Ex通過翅下靜脈分別注射至3只7日齡SPF雞體內,在注入熒光外泌體后的3,12,24 h,使用小動物活體成像儀進行活體成像,活體成像前排空尿液,使用75%酒精打濕雛雞腹部毛發,異氟烷麻醉雛雞,使用880 nm濾片,功率為3.5 W,在暗場下觀察雛雞體內發出的熒光,記錄400 ms曝光時間下的熒光強度,使用ImageJ軟件比較平均熒光強度,觀測NDV Ex在雛雞體內的分布情況。

1.5 器官中外泌體分布檢測注射外泌體后24 h處死雛雞,取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腦、腸于10 cm2培養皿中,再次用活體成像儀進行圖像采集,用于比較各臟器內外泌體的含量。

1.6 NDV Ex對NDV體內增殖的影響以200 μg NDV Ex或PBS接種7日齡SPF雛雞,2 h后通過滴鼻方式接種105TCID50NA-1,接毒后分別在3,6,12,24,36,48 h,通過Eastep Super Total RNA Extraction Kit提取空白對照組、NDV組和NDV+Ex組雛雞上述各時間點的肺臟、脾臟和肝臟總RNA,隨后使用M-MLV逆轉錄酶、oligo-dT和隨機引物的混合物(1∶1)對所得RNA進行反轉錄。cDNA經無菌蒸餾水稀釋作為qPCR的模板或在-40℃ 保存備用。FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒通過qPCR檢測病毒NP、IFN-α和IFN-β mRNA表達水平變化情況,并使用GAPDH的表達水平進行數據標準化,以基因的相對表達量2-△△Ct計算表達水平。

1.7 肺泡巨噬細胞免疫相關細胞因子轉錄水平與吞噬功能檢測

1.7.1肺泡巨噬細胞分離與表型檢測 頸椎脫臼處死雞,固定后剪開頸部皮膚,分離出氣管,用1 mL 注射器吸取1 mL PBS緩沖液沿向心方向穿刺進入氣管,緩慢推入肺部,靜置2 min再緩慢回抽,將回收的液體注入潔凈的離心管中。重復灌洗9～10次,將灌洗液500 ×g離心10 min,棄上清,加入紅細胞裂解液,混勻細胞,作用3～5 min裂解紅細胞,500 ×g離心10 min,棄上清,用RPMI 1640培養液重懸細胞沉淀,鋪板,用光學顯微鏡觀察細胞形態,48 h后棄去上清并用PBS沖洗3遍,用0.25%胰酶消化貼壁細胞,2 000 r/min離心5 min,棄上清,細胞計數,并用PBS調整細胞濃度為1×106個/mL。取 100 μL 細胞懸液于1.5 mL EP管中,加入1 μL KUL01單克隆抗體,4℃孵育1 h。用PBS洗2次,2 000 r/min離心3 min,以300 μm濾膜過濾后用流式細胞儀檢測細胞表型。

1.7.2肺泡巨噬細胞吞噬功能相關細胞因子檢測 分離3,6,12,24,36,48 h NDV和NDV+Ex組、空白對照組肺泡巨噬細胞,使用qPCR檢測雞肺泡巨噬細胞IL-1β、IL-6和iNOS mRNA表達水平。用于RT-PCR的引物見表1。

表1 熒光定量PCR引物信息

1.7.3NDV Ex對肺泡巨噬細胞吞噬能力的影響 分別分離空白組、6 h NDV組、12 h NDV組、6 h NDV Ex組、12 h NDV Ex組的雞肺臟巨噬細胞,用PBS調整細胞濃度為1×106個/mL。取 100 μL 細胞懸液于1.5 mL EP管中,加入1 μL FITC-dextran,37℃孵育2 h。用PBS洗2次,2 000 r/min離心 3 min,300 μm濾膜過濾后用流式細胞儀進行檢測。

2 結果

2.1 NDV Ex的分離鑒定所分離出的NDV Ex樣本經Western blot檢測出標志蛋白TSG101(圖1A)。分離的外泌體經SDS-PAGE檢測,顯示純度很高且無雜帶(圖1B)。透射電鏡下可觀察到外泌體呈經典“茶杯托”形態,直徑約為100 nm(圖1C)。

A.NDV Ex的分離純化鑒定(M.蛋白Marker;1.protein A/G磁珠聯合CD63抗體純化的NDV Ex;2.經典超速離心法純化的NDV Ex);B.NDV Ex的SDS-PAGE分析(M.蛋白Marker;1.protein A/G磁珠聯合CD63抗體純化的NDV Ex);C.透射電鏡下負染色的NDV Ex

2.2 NDV Ex的體內遷移研究

2.2.1外泌體大體分布 經活體成像檢測,可見DiR-Ex和 DiR均可在雞體內富集(圖2A),其富集位置集中在腹部。在相同拍照條件下,各時間點的DiR-Ex組平均熒光強度全部高于DiR組(圖2B),且熒光強度在24 h 內維持穩定(圖2C)。

A.外泌體大體分布活體成像;B.注射后不同時間熒光強度檢測結果;C.注射后不同時間熒光強度變化。ns.示無顯著性差異;*.示P<0.05;***.示P<0.01。下同

2.2.2外泌體的器官分布 試驗組與對照組肝臟和脾臟上有較強熒光,但無顯著性差異;但試驗組肺組織可見較強熒光信號,而對照組無熒光信號(圖3A)。另外,試驗組與對照組的肝臟都有熒光,試驗組顯著高于對照組(圖3B)。

A.注射外泌體24 h后,各臟器內外泌體含量檢測;B.肺臟、脾臟、肝臟外泌體熒光強度檢測

2.3 NDV Ex對NDV體內增殖的影響

2.3.1NDV Ex對NDV體內病毒載量的影響 從整體上分析肺臟、脾臟和肝臟各個時間點的病毒載量,NDV+Ex組幾乎全部多于或等于NDV組(圖4),顯示出NDV Ex對病毒在體內增殖的促進作用。各個器官病毒載量的變化又有一定的區別,脾臟在24 h時NDV+Ex組病毒載量低于NDV組,而后略高于NDV組(圖4B);肝臟則在12 h NDV+Ex組的病毒載量便接近NDV組,而后略高于NDV組且兩者都沒有較大波動(圖4C)。而肺臟則有所不同,NDV+Ex組在24 h病毒載量接近NDV組,而后又有較大增加,在48 h再次降低接近NDV組(圖4A)。

2.3.2NDV感染后NDV Ex對肺臟、脾臟和肝臟IFN-α、IFN-β轉錄水平變化的影響 肺臟NDV組的IFN-α、IFN-β在12 h前全部高于NDV+Ex組,且在6 h兩者差異最大,12～36 h NDV組與NDV+Ex組基本持平,而48 h NDV組又再次高于NDV+Ex組(圖5A,D),對肺臟進行檢測發現,和NDV組相比,NDV+Ex在48 h內均發揮了抑制IFN-α、IFN-β轉錄水平的作用。脾臟NDV組的IFN-α、IFN-β在12 h之前全部高于NDV+Ex組,且在6 h兩者差異最大,而在12～24 h時,NDV組與NDV+Ex組基本持平,與肺臟表現不同的是,在24～48 h時,NDV+Ex組略高于NDV組且差距逐漸增大(圖5B,E)。肝臟NDV組的IFN-α、IFN-β在3 h 略低于NDV+Ex組,6～24 h顯著高于NDV+Ex組,在12 h兩者差異最大,而在24～48 h時,NDV+Ex組明顯高于NDV組且差距逐漸增大(圖5C,F)。

2.4 NDV感染后肺泡巨噬細胞免疫相關細胞因子轉錄水平與吞噬能力檢測

2.4.1貼壁不同時間肺泡巨噬細胞的形態觀察 光學顯微鏡下可見,雞肺泡巨噬細胞在貼壁培養6～12 h時,細胞量較多細胞雜亂。培養24～36 h時,雜細胞變少,細胞呈圓形、梭形和不規則形等形態,符合巨噬細胞的形態特征。培養48 h后細胞量開始變少,輪廓模糊不清。由此可見,最佳分離條件為貼壁培養24 h(圖6)。

圖6 肺泡巨噬細胞貼壁不同時間的形態觀察(200×)

2.4.2流式細胞術檢測細胞表型 結果顯示,成功分離出了肺臟巨噬細胞,分離效率約為82.26%(圖7)。

圖7 流式細胞術檢測細胞表型

2.4.3肺泡巨噬細胞免疫相關細胞因子檢測 使用RT-PCR檢測肺泡巨噬細胞免疫相關細胞因子,結果顯示在所有時間段NDV組的IL-1β、IL-6和iNOS mRNA的表達水平均明顯高于NDV+Ex組(圖8),而在不同時間點三者表現稍有不同。IL-1β在6 h時NDV與NDV+Ex組均達到了一個頂點,12～36 h時NDV組含量降低,兩者差距逐漸縮小,在36 h后NDV組再次高于NDV+Ex組(圖8A);IL-6則是在12 h時NDV與NDV+Ex組均到達第一個頂點,而后NDV組含量降低兩者差距逐漸縮小,直到48 h時NDV組再次高于NDV+Ex組(圖8B); iNOS在3 h和6 h時間點NDV組與NDV+Ex組兩者含量都在同步增加,在6 h后NDV組含量開始超過NDV+Ex組,并在24 h到達第一個頂點,而NDV+Ex組則與NDV組相反,在24 h到達低點,而后兩者逐漸接近,在36 h時趨同,在48 h NDV組又再次高于NDV+Ex組(圖8C)。

圖8 肺巨噬細胞免疫相關細胞因子檢測

2.4.4NDV Ex對肺泡巨噬細胞吞噬能力的影響 從前面結果來看在NDV感染進程中NDV Ex會在6 h和12 h對病毒載量與細胞因子產生影響,因此我們使用流式細胞術研究6 h和12 h NDV組和NDV+Ex組肺泡巨噬細胞吞噬能力的變化。結果顯示,在6 h NDV組與NDV+Ex組吞噬能力均弱于PBS組,NDV+Ex組明顯弱于NDV組;在12 h NDV組與NDV+Ex組吞噬能力較6 h更為減弱,且NDV+Ex組下降更為明顯并顯著弱于NDV組(圖9)。試驗表明NDV Ex在NDV 感染過程中影響了肺泡巨噬細胞的吞噬能力。

圖9 NDV感染后NDV Ex對肺泡巨噬細胞的影響

3 討論

外泌體被釋放到細胞外之前會包裹一系列蛋白質及核酸,外泌體較為穩定的磷脂雙分子層結構可以保護外泌體內容物不被外界降解[10-11]。外泌體也具有良好的生物活性,得益于外泌體表面的CD47,它能夠阻止外泌體在血液循環系統中被單核細胞清除,因此外泌體具有足夠時長的循環半衰期和免疫逃逸能力[12-13]。由于病原體感染會導致細胞代謝活性發生改變,而且多種病毒可以利用外泌體釋放完成自身的復制與釋放,因此多種病原體感染會改變外泌體的釋放,并且外泌體可以在病毒的感染進程中發揮重要作用[14-15]。早在2003年就有學者提出,逆轉錄病毒可以利用外泌體形成與分泌的途徑合成新的感染性病毒粒子[16-18];2013年發表在《Nature》上的一項研究報道顯示,甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)本身不具有囊膜結構,但它可以在復制時通過類似途徑合成具有膜結構的病毒顆粒——“囊膜的HAV(enveloped HAV,eHAV)[19-21]。本實驗室前期研究發現,NDV Ex不能在受體細胞中建立感染,但可以促進NDV在體外細胞系DF-1中的復制,但NDV在雛雞體內感染進程中NDV Ex所發揮的作用并不清楚。

在對NDV Ex在雛雞體內遷移分布情況的研究中,我們發現NDV Ex能遷移分布到雛雞的肺臟、脾臟和肝臟,其中肺臟聚集最多;在24 h內也有良好的蓄積效果,且其他組織對NDV Ex沒有明顯的攝取作用,提示NDV Ex可能靶向于這些器官。在研究NDV Ex對NDV增殖的影響時,發現NDV Ex會促進NDV在體內的復制。在研究NDV Ex對Ⅰ型干擾素表達量的影響時,實驗室前期研究發現在強毒NDV刺激下,IFN-α、IFN-β表達量逐漸升高并在48 h達到峰值后下降[22]。本試驗中,24 h之前NDV Ex組的IFN-α、IFN-β含量受到抑制,后期接近于NDV組;而24 h后NDV組和NDV Ex組IFN-α、IFN-β表達量有所差異,可能是由于NDV Ex在不同組織器官中蓄積時間及蓄積量的不同導致。為了進一步探究NDV感染過程中NDV Ex所發揮的作用,選取了在體內遷移研究中NDV Ex含量最高的肺臟進行試驗,結果表明NDV Ex顯著抑制了肺泡巨噬細胞吞噬相關細胞因子IL-1β、IL-6和iNOS mRNA表達水平,從細胞因子水平上說明在NDV感染過程中NDV Ex干擾了肺泡巨噬細胞的吞噬能力。總體來看,NDV組與NDV Ex組在6 h和12 h時兩組病毒載量與細胞因子產生了較大變化,也在此時段最先發生變化,因此本試驗使用流式細胞術研究6 h和12 h時NDV組和NDV Ex組肺泡巨噬細胞吞噬能力變化,結果表明,兩個時間點NDV Ex組吞噬功能明顯弱于NDV組,且12 h時NDV Ex組與NDV組的吞噬功能差異更顯著,NDV Ex降低了肺泡巨噬細胞的吞噬功能。

本研究通過雛雞體內試驗探究了NDV Ex在NDV體內感染進程中所發揮的作用。結果表明NDV Ex可以在雛雞體內蓄積,并在NDV感染進程中抑制了體內的干擾素水平、肺泡巨噬細胞吞噬活性相關細胞因子水平。可能是這些因素導致NDV Ex促進了NDV的體內增殖。有研究顯示,外泌體可以引起巨噬細胞的極化功能改變[23-24],因此下一步試驗將針對此方面做進一步的研究。本試驗主要探究了NDV Ex在NDV體內感染中的表現,為闡明NDV在機體內的致病機制奠定了基礎,為抗擊病毒感染提供了新的思路。