ROCK2-shRNA轉染對VaD大鼠海馬神經元的保護作用*

向軍軍 秦紅玲 盧健鋒 楊璧璘 鄧秋媚 陳煒 胡躍強

(1.廣西中醫藥大學第一附屬醫院,廣西 南寧 530023;2.南寧市第一人民醫院,廣西 南寧 530023;3.廣西賀州市中醫醫院,廣西 賀州 530023;4.廣西中醫藥大學,廣西 南寧 530023)

血管性癡呆(Vascular dementia,VaD)已成為了繼阿爾茨海默病后最常見的癡呆類型[1-2],然其具體發病機制尚未明了,目前認為神經元和突觸可塑性損傷可能是導致學習、記憶及認知功能障礙的關鍵因素[3]。

研究[4-6]表明,Ras同源基因實驗成員(Ras homolog gene family member A, RhoA)/Rho關聯卷曲螺旋蛋白激酶2(Rho-associated coiled coil-forming protein kinase 2,ROCK2)通路是參與大腦神經軸突再生和神經功能恢復的關鍵通路,而ROCK2表達變化與炎癥誘導的突觸可塑性損傷密切相關。因此,干預ROCK2基因表達有望成為治療VaD的新靶點。使用腺相關病毒(Adeno-associated virus,AAV)載體表達短發夾架構RNA(Short hairpin RNA,shRNA)能夠長效敲低基因,具有特異、高效等優點,且通過血腦屏障效率高,逐漸成為神經系統疾病實驗研究的新熱點[7]。本研究探討AAV9-ROCK2-shRNA對VaD大鼠海馬神經元的保護作用,探索一個適宜的腺相關病毒注射滴度,以期實現對VaD的精準治療。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑及器材 腺相關病毒原液AAV9-ROCK2-shRNA(由上海吉滿生物科技有限公司提供);水合氯醛(天津市大茂化學試劑廠,批號302-17-0);蘇木精-伊紅染色試劑盒由索萊寶有限公司提供;Morris 水迷宮視頻分析系統(上海軟隆科技發展有限公司,型號BW-MMM101);光學顯微鏡(日本Olympus公司,IX73型)大鼠腦立體定位儀(日本成茂公司)。

1.2 實驗動物及分組 成年SPF級健康雄性SD大鼠40只,體重250±50g,由湖南斯萊克景達物實驗動物有限公司提供,動物許可證號:SCXK湘2019-0004。隨機分為:正常組、PBS對照組(PBS液體代替病毒制劑)、低滴度組、中滴度組和高滴度組,每組8只,各組大鼠正常喂養,術后4周取材。實驗過程中動物喂養及取材等操作均遵守實驗動物管理和保護的有關規定。

1.3 方法

1.3.1 腺相關病毒稀釋 AAV9-ROCK2-shRNA腺相關病毒原液的滴度為1.14E+13 VG/mL,按照2倍及10倍稀釋,滴度分別為5.07E+12 VG/mL、1.14E+12 VG/mL。

1.3.2 腦立體定向注射 參照文獻[8],采用雙側頸總動脈永久性結扎法制備VaD模型。造模后第2 d評估模型成功后,立即進行立體定位手術,給予注射低滴度、中滴度、高滴度腺相關病毒4 μL,持續5 min。注射位置:坐標(以前囟為0點)-皮質(前):向前1.0 mm,右側旁開2.0 mm,深度1.2 mm;皮質(后)向后3.0 mm,右側旁開1.5 mm,深度1.2 mm;海馬:向后3.5 mm,右側旁開2.5 mm,深度3.0 mm。PBS對照組則以生理鹽水代替注射。

1.3.3 實驗動物取材及處理 腦立體注射術后4周,以4%多聚甲醛經心臟灌流固定后,取海馬組織,每組中4只行石蠟切片,用于HE染色和Nissl染色觀察大鼠海馬神經元形態改變及尼氏小體數量;另4只進行免疫組化觀察炎癥因子IL-1β蛋白表達情況及綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP),并通過Image Pro Plus 6.0軟件測量分析熒光強度。

1.3.4 轉染效率計算 熒光顯微鏡下直接觀察綠色熒光蛋白GFP)的表達,每張切片隨機取10個100倍視野,計算GFP陽性細胞數占總細胞數的百分比,即為估算的轉染效率。

2 結果

2.1 各組大鼠學習記憶能力比較 術前各組大鼠潛伏期及跨越平臺次數比較,差異無統計學意義(P>0.05)。術后1周,與正常組比較,PBS對照組潛伏期顯著延長、跨越平臺次數明顯減少(P<0.05);PBS對照組與低、中、高滴度相互之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。術后4周,與正常組比較,PBS組潛伏期顯著延長及跨越平臺次數明顯減少(P<0.05);與PBS組比較,中滴度組潛伏期縮短、跨越平臺次數增加(P<0.05),低、高滴度組潛伏期及跨域平臺次數差異無統計學意義(P>0.05);與中滴度組比較,低、高滴度組潛伏期延長、跨越平臺次數減少(P<0.05)。與術前比較,術后1周的正常組潛伏期縮短、跨越平臺次數增加(P<0.05),PBS對照組、低滴度、高滴度組潛伏期與跨越平臺次數無明顯差異(P>0.05);與術后1周比較,術后4周正常組、中滴度組潛伏期時間縮短、跨越平臺次數明顯增加(P<0.05),而PBS對照組、低滴度及高滴度組差異均無統計學意義(P>0.05)。術后1周與術前比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮跨越平臺次數比較Table 1 Comparison of crossing platform times in Morris water maze in each group

2.2 各組HE染色比較 正常組海馬區神經元排列緊湊、飽滿、圓潤,細胞核清晰;PBS對照組海馬區神經細胞神經細胞排列散亂、稀疏,可見細胞核腫脹破裂,部分胞漿濃縮;低滴度組大鼠海馬區神經元形態有明顯改善,但細胞結構不清晰,可見胞膜破裂,仍稍有腫脹;中滴度組大鼠海馬區神經元飽滿、圓潤,胞體較大且胞質豐富,細胞核清晰,排列緊湊;高滴度組海馬組織區域結構出現明顯異常增生及條索化,出現核固縮染色加深。見圖1。

圖1 4周后各組大鼠海馬組織HE染色(100×)Figure 1 HE staining was performed on the hippocampal tissues of each group after 4 weeks注:A.正常組;B.PBS對照組;C.低滴度組;D.中滴度組;E.高滴度組。

圖2 4周后各組大鼠海馬組織Nissl染色(200×)Figure 2 After 4 weeks, Nissl staining was performed on the hippocampus of each group注:A.正常組;B. PBS對照組;C.低滴度組;D.中滴度組;E.高滴度組。

2.3 各組Nissl染色比較 正常組海馬組織中尼氏小體結構排列整齊、緊密,且結構清晰;PBS對照組組織中尼氏小體排列散亂、尼氏小體數較正常組明顯減少(P<0.05);與PBS組比較,低滴度組神經元仍稀疏松散、尼氏小體數量少差異均無統計學意義(P>0.05);與低滴度組比較,中滴度組中神經元結構完整、排列整齊,可見豐富的尼氏小體;與中滴度組比較,高滴度組海馬神經元損傷程度增加、組織結構不清晰,尼氏小體變小,數目較中滴度明顯減少(P<0.05)。

2.4 各組海馬組織IL-1β表達情況比較 IL-1β陽性細胞胞漿呈棕黃色,背景為淡黃色。正常組海馬區IL-1β棕色表達量少;與正常組比較,PBS對照組海馬組織IL-1β蛋白含量高,在海馬各區陽性表達多(P<0.001)。與PBS對照組比較,低、中、高組IL-1β表達明顯減少(P<0.05);與中滴度比較,低、高滴度IL-1β表達增加,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 4周后各組大鼠海馬區IL-1β表達情況(100×)Figure 3 Four weeks after each rat hippocampus IL-1 beta expression注:A.正常組;B. PBS對照組;C.低滴度組;D.中滴度組;E.高滴度組。

2.5 綠色熒光蛋白在海馬組織中的表達 不同滴度的腺相關病毒轉染腦組織4周后,均可在針道周圍觀察到少量GFP表達,其中陽性表達為相應熒光素標記的綠光。而在PBS對照組中則未見GFP表達。按照轉染率計算法可得出:低滴度組腺病毒轉染效率為(19.79±6.55) %,明顯低于中、高滴度注射組(P<0.05);而與中滴度(28.55±4.22) %比較,高滴度注射組(22.52±8.94)%的轉染效率較低,可見有細胞核破裂,形態不規則,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 各觀察組轉染后4周缺血腦組織GFP表達(熒光顯微鏡100×)Figure 4 Expression of GFP in ischemic brain tissue 4 weeks after transfection注:A. PBS對照組;B.低滴度組;C.中滴度組;D.高滴度組。

3 討論

海馬神經元炎癥損傷作為VaD發生、發展的重要因素,已得到普遍認可[9];其中IL-1β作為炎癥級聯反應的重要因子,正常生理情況下,其在腦組織內的表達水平極低,而其高表達在神經炎癥發生、發展和免疫反應中起重要作用[10]。研究[11]表明,在顱腦內IL-1β不僅參與中樞神經系統的發育和生長調節,也參與病理狀態下的神經系統的損傷過程,如腦缺血、腦損傷、阿爾茨海默病等。大量分泌的IL-1β可通過多個環節參與神經元損傷,最主要是啟動多種細胞因子級聯反應[12]。文獻[13]報道,增加的IL-1β可能參與大鼠記憶障礙和抑制長時程突觸傳遞增強造成學習、記憶及認知障礙。有的研究[14-15]證實,IL-1β的釋放受ROCK2的調控,因此,敲減或者沉默ROCK2的表達有可能抑制IL-1β的分泌,從而起到保護神經元的作用。本研究結果也證實ROCK2-shRNA中劑量組能顯著減少IL-1β陽性細胞,改善大鼠智能。

AAV載體具有較高的安全性、低免疫原性、可持續表達等特性,近年來逐漸成為神經系統研究以及基因治療的重要工具之一[16]。但由于載體轉導效率的限制、脫靶和給藥后中和抗體的產生等阻礙其進入靶細胞,降低轉基因的表達效率,而高濃度的AAV病毒顆粒又可引發蛋白酶體介導的細胞降解和病毒顆粒的損失,降低其轉染效率。除此之外,AAV在體內轉導的表達時間也會對實驗研究觀察周期帶來影響。因此,探索具有轉染率高、安全性好、毒副作用少的適宜滴度是當前亟需解決的問題[17-19]。本研究采用低、中、高3種不同滴度的AAV9-ROCK2-shRNA進行觀察,發現術后4周,各病毒注射組行為學、神經功能缺損及各項監測指標均有所改善,而以中滴度組療效最為明顯。這與周斌等[20]采用AVV9病毒觀察對神經元保護作用的影響的研究結果有相似之處。

本研究結果提示,可知適宜的腺相關病毒滴度是影響轉染效果的關鍵因素之一;當滴度太低,會造成轉染不充分,造成轉染率太低,影響效果;當滴度太高時,細胞會因毒性太大而出現神經元及周圍組織損傷。本研究采用3種滴度證實不同滴度存在的效果差別,篩選出中滴度可作為適宜的注射滴度,并且在一定程度上證實AAV9-ROCK2-shRNA成功轉染后可有效發揮其對海馬神經元的保護功能,為后續研究RhoA/ROCK2信號通路對VaD大鼠的神經保護作用及機制提供了實驗基礎。

4 結論

中滴度AAV9-ROCK2-shRNA能高效、穩定、低毒地轉染大鼠海馬組織,對VaD大鼠海馬神經元保護作用最優。