基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討益氣活血方治療糖尿病腎病的作用機(jī)制*

盧洪梅 鐘月圓 羅怡鈺 楊亞軍 阮永隊(duì)

(廣東醫(yī)科大學(xué),廣東 東莞 523808)

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,其發(fā)病人數(shù)占全球糖尿病患者的20%～40%[1-2]。中藥作為DN治療的主要或者替代療法具有良好的療效和廣闊的臨床應(yīng)用前景[3-4]。前期研究發(fā)現(xiàn)益氣活血方治療DN有著良好臨床療效[5]。全方益氣、活血、化瘀,兼補(bǔ)益脾腎,不但能改善患者的腎臟功能、延緩DN發(fā)展,而且可以穩(wěn)定血糖水平,降低糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生率。但該方成分多而復(fù)雜,其治療DN的主體成分及作用機(jī)制尚不清楚。本研究擬通過(guò)中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù),分析自擬益氣活血方在治療DN中的有效活性成分、潛在作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制,旨在為 DN 的臨床治療提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 自擬益氣活血方中活性成分的獲得 益氣活血方組成:黃芪30 g,山藥30 g,五指毛桃30 g,菟絲子 20 g,補(bǔ)骨脂20 g,桃仁20 g,丹參15 g,三七15 g,益母草15 g。在 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索藥物活性成分,口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(Drug-likeness,DL)≥ 0.18為篩選條件,獲得其活性成分。應(yīng)用ETCM 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索以補(bǔ)充未檢索得到的獲得其化學(xué)成分。通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)中所得化學(xué)成分的SDF分子結(jié)構(gòu),將其導(dǎo)入SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得該中藥的有效活性成分。

1.2 預(yù)測(cè)自擬益氣活血方的作用 靶點(diǎn)通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取上述步驟中所得各活性成分的SDF分子結(jié)構(gòu),利用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得各活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。選擇 Probability≥0.15 的靶點(diǎn)作為成分靶點(diǎn),并通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)成分靶點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)充[6]。

1.3 DN疾病靶點(diǎn)的獲得運(yùn)用 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNEt 數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD 治療目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)、 GeneCards 人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)、 OMIM 在線孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/)、 DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)共6個(gè)數(shù)據(jù)來(lái)源,同時(shí)依據(jù)已有文獻(xiàn)未預(yù)測(cè)到的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)充,確定最終的DN疾病靶點(diǎn)。將成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集,繪制藥物-疾病交集靶點(diǎn)維恩圖。

1.4 構(gòu)建交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)以篩選核心靶點(diǎn) 運(yùn)用Cytoscape 3.7.0 中的 BisoGenet 插件構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape軟件的analyze network功能和 CytoNCA 插件計(jì)算分析交集靶點(diǎn) PPI 的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)特征屬性值,對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行中心性分析,得到核心靶點(diǎn)和關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 交集靶點(diǎn)與核心靶點(diǎn)的GO功能與KEGG通路富集分析 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù) Metascape ,進(jìn)行生物信息富集分析,包括生物過(guò)程(Biological processe,BP)、分子功能(Molecular function,MF)和細(xì)胞組分(Cell componen,CC)以及KEGG信號(hào)通路富集分析。

1.6 構(gòu)建“活性成分-交集靶點(diǎn)”與“功能-交集靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò)使用 Cytoscape 3.7.0 構(gòu)建自擬益氣活血方“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),達(dá)到可視化的目的。分析其網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù),包括連接度(Degree)、介度(Betweenness)、緊密度(Closeness)等,以探究自擬益氣活血方中活性成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系。

1.7 關(guān)鍵靶點(diǎn)與主要活性成分的分子對(duì)接分析 應(yīng)用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)、PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并下載關(guān)鍵靶點(diǎn)、活性成分的3D結(jié)構(gòu)文件。使用Autodock Tools1.5.6 和Autodock Vina1.1.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接,通過(guò)分子可視化軟件PyMol 2.4.0與R4.1.1分別繪制示意圖及結(jié)果熱圖。

2 結(jié)果

2.1 自擬益氣活血方活性成分及靶點(diǎn)的獲取分析 初步獲得益氣活血方的化學(xué)成分共691種,重要活性成分114種,其中黃芪20種,山藥6種,菟絲子11種,桃仁6種,丹參30種,三七4種,益母草8種,五指毛桃16種,補(bǔ)骨脂13種。對(duì)得到的成分靶點(diǎn)去重,獲得預(yù)測(cè)靶點(diǎn)223個(gè)。見(jiàn)表1。

表1 益氣活血方主要活性成分信息Table 1 Information on active components of Yiqi Huoxue Prescription

2.2 獲取DN相關(guān)靶點(diǎn) 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)得到DN疾病靶點(diǎn)4個(gè),DisGeNEt 數(shù)據(jù)庫(kù)得到靶點(diǎn)206個(gè),TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)得到點(diǎn)7個(gè),通過(guò) GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)得到880個(gè),通過(guò) OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)得到77個(gè),通過(guò) DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)得到44個(gè)。將得到的靶點(diǎn)通過(guò) Uniport 數(shù)據(jù)庫(kù)將基因名稱標(biāo)準(zhǔn)化。將標(biāo)準(zhǔn)化的基因名稱匯總、去重,共獲得 DN 相關(guān)靶點(diǎn)1002個(gè),交集靶點(diǎn)81個(gè),見(jiàn)圖1。

圖1 益氣活血方成分靶點(diǎn)與DN疾病靶點(diǎn)的交集韋恩圖Figure 1 Venn diagram of Yiqi Huoxue Prescription targets and Diabetic Nephropathy targets

2.3 構(gòu)建交集靶點(diǎn) PPI 網(wǎng)絡(luò)以篩選關(guān)鍵靶點(diǎn) 構(gòu)建自擬益氣活血方與 DN 的 PPI 網(wǎng)絡(luò)。利用 PPI 的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)特征屬性值的相關(guān)中位值為篩選標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行兩次篩選,得到374個(gè)核心靶點(diǎn)。同時(shí),核心靶點(diǎn)與上述得到的交集靶點(diǎn)取交集,得到15個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

圖2 益氣活血方治療DN的核心靶點(diǎn)Figure 2 Hub protein in treatment of Diabetic Nephropathy by Yiqi Huoxue Prescription注:A.益氣活血方核心靶點(diǎn)的篩選策略示意圖;B.益氣活血方治療DN的374個(gè)的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。CC.緊密度中心性;DC.連接度中心性;BC.介度中心性。

2.4 交集靶點(diǎn)與核心靶點(diǎn)的GO和KEGG富集分析 通過(guò) Metascape 對(duì)自擬益氣活血方治療 DN 的交集靶點(diǎn)進(jìn)行生物功能分析,并將logP 值排名前10的條目繪成氣泡圖進(jìn)行可視化。結(jié)果表示自擬益氣活血方通過(guò)多靶點(diǎn)-多通路來(lái)達(dá)到治療 DN 的目的。見(jiàn)圖3。

圖3 益氣活血方治療 DN 交集靶點(diǎn)的富集分析結(jié)果圖Figure 3 Enrichment analysis result charts of intersection targets in treatment of Diabetic Nephropathy by Yiqi Huoxue Prescription注:A.交集靶點(diǎn)在分子功能 (MF)、生物過(guò)程(BP)和細(xì)胞組分 (CC)的 GO 分析氣泡圖;B.交集靶點(diǎn)KEGG通路富集分析氣泡圖。

2.5 構(gòu)建“活性成分-交集靶點(diǎn)”與“功能-交集靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò) 利用 Cytoscape 3.7.0 繪制并分析自擬益氣活血方中的“活性成分-交集靶點(diǎn)”與“功能-交集靶點(diǎn)-通路”的關(guān)系網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖4。

圖4 益氣活血方可視化網(wǎng)絡(luò)圖Figure 4 Visual network of Yiqi Huoxue Prescription注:A.益氣活血方的活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,其中 DS、 BGZ、 WAMT、SY、TSZ、TR、HQ、SQ、YMC 分別是丹參、補(bǔ)骨脂、五指毛桃、山藥、菟絲子、桃仁、黃芪、三七、益母草的簡(jiǎn)寫;B.益氣活血方治療 DN 的功能-交集靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

2.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)與重要活性成分的分子對(duì)接分析 將得到的15個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與“活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中度值前15的活性成分逐個(gè)進(jìn)行分子對(duì)接(見(jiàn)圖5 A)。最低結(jié)合效能小于-5 kcal/mol的結(jié)果有198對(duì)。本自擬益氣活血方活性成分與AKT1、 PARP1、 PTPN11親和力均較好,見(jiàn)圖5B～D。

圖5 益氣活血方核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接可視化Figure 5 Visualization of docking between active molecules of Yiqi Huoxue Prescription and key target molecules注:A.核心化合物和關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接熱圖;B.山萘酚與靶點(diǎn) PTPN11 的分子對(duì)接;C.木犀草素與靶點(diǎn) AKT1 的分子對(duì)接;D.槲皮素與靶點(diǎn) PARP1 的分子對(duì)接。

3 討論

DN的發(fā)病機(jī)制是復(fù)雜和多因素的,包括遺傳、代謝和血流動(dòng)力學(xué)等因素[7-8]。特定代謝驅(qū)動(dòng)的葡萄糖依賴性途徑和各種血管活性激素途徑在糖尿病腎組織內(nèi)被激活,各種途徑和介質(zhì)之間存在大量重疊的相互作用是DN發(fā)病機(jī)制仍未被完全了解的重要原因[9-10]。由于臨床治療中的主要方法具有局限性,而黃芪、山藥、丹參、菟絲子、三七、益母草等中藥可通過(guò)多途徑減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生從而改善DN患者的腎臟功能,由此DN可能需要靶向這種疾病多種相關(guān)介質(zhì)以協(xié)同治療。在本自擬益氣活血方的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中,我們得到該處方對(duì)于DN具有治療作用的重要活性成分、靶點(diǎn)和富集通路,并對(duì)其中的關(guān)鍵靶點(diǎn)及其作用機(jī)制進(jìn)行分析。

益氣活血方主要活性成分為黃酮類化合物,包括山柰酚、木犀草素、槲皮素、異鼠李素、芹菜素、金和歡素、補(bǔ)骨脂異黃酮醛等。相關(guān)研究[11-12]表明,天然黃酮類化合物具有多種作用機(jī)制,包括抗氧化應(yīng)激、改善血糖血脂紊亂、抗炎、抗凋亡、調(diào)節(jié)血管舒張及改善血流動(dòng)力學(xué)異常等,可以預(yù)防和治療DN。在益氣活血方中,異鼠李素、槲皮素、芹菜素和木犀草素共同作用,通過(guò)抑制炎癥和消除自由基來(lái)治療DN[13-14]。黃芪、菟絲子、益母草、五指毛桃中的共有成份山柰酚可以通過(guò)增強(qiáng)GLP-1、胰島素的釋放和Rho激酶的抑制來(lái)改善腎損傷并減少纖維化[15]。花生四烯酸可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力、腎小球高通率正常化和內(nèi)皮糖黃質(zhì)的恢復(fù),從而治療DN[16]。而棕櫚酸、a1-谷甾醇、補(bǔ)骨脂異黃酮醛等活性成分的具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。

胰島素受體酪氨酸磷酸化是糖代謝的重要因素[17]。Akt是一個(gè)重要介質(zhì),可以調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和基質(zhì)上調(diào)。益氣活血方的靶點(diǎn)PTPN1和PTPN11可以調(diào)節(jié)胰島素抵抗下游信號(hào)蛋白IRS-1的磷酸化,同時(shí)ESR1和PPARG等關(guān)鍵靶點(diǎn)也參與了胰島素抵抗的調(diào)節(jié)[18-19]。在DN病理機(jī)制的研究中,PARP1和PIK3R1等靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)與自噬有關(guān)[20]。同時(shí),STAT3和GSK-3β等靶點(diǎn)也與腎纖維化相關(guān)[21]。益氣活血方還具有調(diào)節(jié)炎癥的作用,可以調(diào)節(jié)NF-κB1、AP-1、PARP1等靶點(diǎn)來(lái)抑制促炎因子的誘導(dǎo)[22]。在臨床研究中,一些趨化因子及其受體、細(xì)胞因子、NF-κB1、PI3K-Akt和JAK-STAT通路的相關(guān)制劑顯示出顯著的療效。

GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示,益氣活血方治療DN主要通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素抵抗、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化以及PPAR信號(hào)通路等幾個(gè)信號(hào)通路發(fā)揮作用。在這些通路中,本處方的活性成分通過(guò)與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合發(fā)揮作用。其中,mTOR被認(rèn)為是DN中最關(guān)鍵的自噬調(diào)節(jié)劑之一[23],本處方可通過(guò)調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路預(yù)防DN的發(fā)生和進(jìn)展。此外,PPAR信號(hào)通路可抑制炎癥反應(yīng),并通過(guò)PI3K-AKT通路、瘦素通路和脂聯(lián)素通路來(lái)增加外周組織對(duì)胰島素的敏感性,從而改善胰島素抵抗,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)[24]。雖然已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了該方劑的活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合性,但部分活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的相互作用仍需進(jìn)一步研究。

總之,本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接相關(guān)理論初步探究了該自擬益氣活血方治療DN的作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究是基于現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)研究及數(shù)據(jù)而進(jìn)行的建模,其結(jié)果與實(shí)際效果可能存在一定偏差。該研究中,即使分子對(duì)接結(jié)果顯示該方劑的多種活性成分對(duì)多個(gè)DN靶點(diǎn)具有較好的親和力,但其作用機(jī)制卻鮮有研究報(bào)道。具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究分析,以對(duì)其療效進(jìn)行驗(yàn)證。因此,望本研究可為今后的深入研究提供理論基礎(chǔ),為DN的治療提出新的治療思路。

4 結(jié)論

益氣活血方可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥與細(xì)胞自噬、促進(jìn)ECM蛋白的降解、調(diào)節(jié)外周組織對(duì)胰島素的敏感性及胰腺β細(xì)胞的增殖和凋亡等作用機(jī)制達(dá)到治療DN的作用。