miR-137通過調控血紅素鐵輸出蛋白FLVCR、BCRP對大鼠I/R損傷的保護作用*

袁莉 鄧秋媚 向軍軍 陳煒 胡躍強 姚春

(1.廣西中醫藥大學,廣西 南寧 530020;2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院,廣西 南寧 530020)

缺血性中風(Ischemic stroke, IS)是一種致殘率和死亡率很高的腦血管疾病,為全球第二大死亡原因[1]。目前,急性缺血性腦卒中可用的治療方法是再通治療策略。由于時間或適應癥的限制,它們僅適用于少數患者,并且效果中等。此外,抗血小板藥物具有高顱內出血風險,并且抗凝劑不能改善長期結果。與世界其他國家相比,我國IS的復發率最高[2]。研究[3]表明,線粒體鐵死亡和miRNA等在IS的病理機制中起到重要作用。腦缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)損傷時,游離鐵與血紅素的過度積累,引起神經毒性和線粒體鐵死亡,是卒中損傷的新機制[4]。因此研究與鐵的轉運相關蛋白或受體以及調控miRNA均可以作為I/R損傷的切入點。其中乳腺癌抗性蛋白(Breast cancer resistance protein,BCRP)和貓白血病病毒C亞組受體(Feline leukenmia virus receptor,FLVCR)是新近發現的血紅素鐵輸出蛋白,在缺血或缺氧條件下,兩者的表達和功能會發生變化,導致運輸屏障發生改變,調控其表達可能會對I/R損傷發揮保護作用。miR-137在神經系統疾病中起著重要而復雜的作用,可能是通過調節鐵死亡對IS產生神經保護作用,但對miR-137是否通過調控血紅素鐵輸出蛋白對IS產生作用的相關機制鮮少有報道。因此,初步探討BCRP和FLVCR在大鼠腦I/R損傷后的表達變化以及miR-137對二者的調控作用,從而進一步了解miR-137與血紅素鐵輸出蛋白在IS的相關機制,為改善IS的預后提供一定的實驗和理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠60只(2～3月齡,250±50 g,SPF級),購自廣西中醫藥大學實驗動物中心。由長沙市天勤生物技術有限公司提供,生產許可證號:SCXK(湘)2019-0014。將大鼠飼養在溫度為25 ℃、濕度為45%～65%的條件下,自由獲取食物和水,適應性飼養7 d。本實驗方案通過廣西中醫藥大學動物倫理委員會批準(批準號DW20211204-195)。

1.2 試驗試劑及儀器 ①主要儀器:石蠟切片機(HS-2205,山東歐萊博醫療器械有限公司),高速低溫組織研磨儀(Servicebio),Stereo Drive立體定位系統(NEUROSTAR,德國),PCR擴增儀(瑞士Roche公司),高速離心機(賽默飛世爾科技,USA),光學顯微鏡(Olympus)。②主要試劑:rno-miR-137-3p mimics AAV和rno-miR-137-3p inhibitor AAV購自上海吉滿生物科技有限公司,mRNA擴增試劑盒(上海生物科技有限公司),TRIzolTM試劑(Ambion),mRNA逆轉錄試劑盒、miRNA逆轉錄試劑盒和miRNA擴增試劑盒購自新貝生物科技有限公司,二抗山羊抗兔IgG HRP(Biosharp,中國),Anti-FLVCR抗體(上海康朗生物科技有限公司),Anti-BCRP抗體(北京Affinity Biosciences公司)。

1.3 實驗分組 將大鼠隨機分成假手術(Sham operation, SO)組、模型(MCAO/R)組、miR-137模擬物(Mimic)組、miR-137模擬對照(Mimic對照)組、miR-137抑制物(Inhibitor)組、miR-137抑制對照(Inhibitor對照)組(n=10)。SO組:以假手術代替缺血再灌注,僅暴露大鼠頸動脈并縫合。MCAO/R組:大鼠行大腦中動脈閉塞2 h后拔出線栓造成再灌注損傷。miR-137mimic組:顱內缺血側MCA區注射miR-137mimic,參照大鼠腦立體定位圖譜,將miR-137 mimic 2μl注射到缺血側MCA附近;7 d后制作MCAO/R模型。miR-137mimic對照組:miR-137mimic空載體代替miR-137mimic,余操作同Mimic組。miR-137 inhibitor組:顱內缺血側MCA區注射miR-137inhibitor 2 μL,余操作同Mimic組。Inhibitor對照組:顱內缺血側MCA區注射miR-137inhibitor空載體,余操作同Mimic組。每只大鼠再灌注后12、24 h處死,取材大鼠缺血半暗帶區腦組織。

1.4 腦立體定位 注射腺相關病毒將大鼠麻醉后固定在腦立體定位儀框架中[5]。吸取2 μL純化后的腺相關病毒,并固定在定位儀上。將注射器針尖移至大腦中動脈標記并鉆孔:AP:0,ML:-2.5 mm,DV:-3.5 mm(相對于前囟點和硬腦膜表面)。進針深度為3 mm后緩慢注射腺相關病毒miR-137mimic或miR-137inhibitor或空載體。7 d后制備MCAO/R模型。

1.5 大鼠MCAO/R模型制備 在Longa線栓法的基礎上加以改良制備大鼠腦MCAO/R模型[6]。根據再灌注方案,2 h后固定大鼠把線栓拔出大約9 mm。Longa＇s評分大于1分則證實造模成功。后再按各組的處理方法處理大鼠,在12 h和24 h兩個時間點處死大鼠。

1.6 檢測方法

1.6.1 神經功能評分 大鼠清醒后用Zea-Longa 5級評分法對大鼠神經功能進行神經功能評分[7]。其中評分為1～3分且無蛛網膜下腔出血的大鼠進入實驗,評分為0分和4分的大鼠剔除。評分越高,說明大鼠神經功能障礙越嚴重。

1.6.2 免疫組織化學染色 腦組織脫水和包埋,石蠟切片切成4 μm并在60 ℃烘烤2 h,將切片用二甲苯Ⅰ和Ⅱ以及梯度酒精進行脫蠟和脫水,高壓修復,PBS沖洗3 min×3次,3%過氧化氫孵育10 min,PBS沖洗3 min×3次,用一抗FLVCR(1∶200)和BCRP(1∶200)37 ℃孵育60 min,PBS沖洗3 min×3次,二抗山羊抗小鼠/兔IgG室溫孵育30 min,PBS沖洗3 min×3次。用DAB顯色,蘇木素復染,梯度酒精脫水,二甲苯透化,中性膠封片。光學顯微鏡觀測,每個切片隨機選擇6個視野。陽性細胞漿或細胞核著色呈棕黃色,采用 Image J軟件檢測圖片的陽性細胞面積,算出AOD值[8]。

1.6.3 qRT-PCR檢測 使用TRIzolTM試劑從腦組織中提取總RNA,mRNA逆轉錄試劑盒和miRNA逆轉錄試劑盒將總RNA合成cDNA。使用擴增試劑盒進行PCR擴增。以GAPDH為內參,以2-ΔΔCT法計算計算FLVCR和BCRP的相對mRNA表達水平[9]。引物序列,見表1。

表1 qRT-PCR中的引物序列Table 1 Primer sequence in qRT-PCR

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 與SO組相比,MCAO/R組大鼠評分明顯升高(P<0.01);與Mimic對照組相比,Mimic組評分明顯降低(P<0.01);與Inhibitor對照組比較,Ihnibitor組評分明顯升高(P<0.05)。見圖1。

2.2 各組大鼠腦組織miR-137、FLVCR、BCRP mRNA表達變化的比較 與SO組相比,MCAO/R組miR-137表達水平明顯降低(P<0.05);與Mimic對照組相比,Mimic組miR-137表達水平明顯升高(P<0.01),且以24 h升高更明顯(P<0.05);與Inhibitor對照組同期比較,Inhibitor組miR-137表達水平明顯降低(P<0.05)。 與SO組各時間點比較,MCAO/R組FLVCR和BCRPmRNA表達降低(P<0.05);與Mimic對照組比較,Mimic組二者表達明顯升高(P<0.01),BCRP mRNA在24 h升高最明顯(P<0.05);與Inhibitor對照組比較,Inhibitor組二者降低(P<0.05),FLVCR mRNA在24 h降低更明顯(P<0.05)。見表2、表3。

表2 大鼠miR-137的表達量比較Table 2 Comparison of miR-137 expression in rats

表3 大鼠FLVCR、BCRPmRNA表達的比較Table 3 Comparison of FLVCR and BCRP mRNA expression in rats

2.3 各組大鼠腦組織FLVCR和BCRP蛋白表達變化的比較 SO組可見大量的FLVCR和BCRP陽性表達。與SO組同期比較,MCAO/R組二者的表達明顯降低(P<0.01);與Mimic對照組比較,Mimic組二者的表達明顯升高(P<0.01),且以24 h升高更明顯(P<0.05);與Inhibitor對照組相比,Inhibitor組二者的表達明顯降低(P<0.05)。見表4、圖2、圖3。

圖2 12 h大鼠FLVCR、BCRP蛋白表達免疫組化圖(400×)Figure 2 Immunohistochemical diagram of FLVCR and BCRP protein expression in 12 h rats 注:A.SO組;B.MCAO/R組;C.Mimic組;D.Mimic對照組;E.Inhibitor組;F.Inhibitor對照組。

圖3 24 h大鼠FLVCR、BCRP蛋白表達免疫組化圖(400×)Figure 3 Immunohistochemical diagram of FLVCR and BCRP protein expression at 24 h in rats注:A.SO組;B.MCAO/R組;C.Mimic組;D.Mimic對照組;E.Inhibitor組;F.Inhibitor對照組。

表4 大鼠FLVCR和BCRP的AOD值比較Table 4 Comparison of AOD values of FLVCR and BCRP in rats

3 討論

鐵元素與中風的發生和發展密切相關,I/R可導致組織的進一步損傷,這涉及鐵離子穩態的改變導致細胞內鐵的積累以及隨之出現的一種新的程序性細胞壞死形式——鐵死亡[10]。在缺氧條件下血紅素的細胞濃度增加,游離血紅素的存在引起有害炎癥和氧化應激[11]。首先,細胞內血紅素的積累最終會導致鐵的積累,并通過芬頓反應(Fenton reaction)產生破壞細胞的活性氧;其次,鐵和血紅素的積累也會導致線粒體功能障礙[12]。細胞內血紅素水平的調節是神經元存活的基礎,FLVCR和BCRP作為血紅素鐵輸出蛋白,能特異性結合或轉運血紅素來減少血紅素的積累,在缺氧狀況下能保護細胞和組織不受游離血紅素的損傷,維持細胞內環境穩態,在IS中發揮至關重要的作用。本研究顯示,MCAO/R組大鼠腦組織中FLVCR和BCRP蛋白表達均明顯降低,提示I/R損傷可抑制腦組織中FLVCR和BCRP表達[13]。研究表明干細胞中的BCRP表達通過防止導致線粒體死亡的血紅素積累來保護造血干細胞免受缺氧環境的影響,提高細胞存活能力。抑制人紅細胞系中的FLVCR功能會減少血紅素輸出,損害紅細胞成熟,并導致細胞凋亡。

miRNA可介導腦缺血再灌注損傷的發生發展[14-15]。其中miR-137可以保護神經元免受OGD/R誘導的細胞損傷[16]。星形膠質細胞中miR-137的水平從缺氧和缺糖環境到正常環境也會增加[15]。miR-137作為腦血管疾病預測的新型生物標志物[17],本研究結果顯示,MCAO/R處理的大鼠腦組織中miR-137水平顯著降低,表明miR-137參與了大鼠腦I/R過程,和之前的研究結果基本一致。Zhang等[18]發現miR-137過表達可減輕腦缺血大鼠腦組織損傷程度,減少氧-葡萄糖剝奪再灌注誘導的細胞損傷,有效改善局灶性腦缺血后的損傷。Liu等[19]發現miR-137可增強腦缺血性卒中小鼠內皮祖細胞的增殖和血管生成。miR-137還可能通過抑制炎癥標志物的釋放來減少腦梗死體積,改善MCAO大鼠的認知功能[20]。本研究中通過表達miR-137改善了MCAO/R誘導的 miR-137 水平的降低,改善了MCAO/R處理的大鼠神經功能缺損,升高FLVCR/BCRP的表達。提示miR-137能增加內源性FLVCR和BCRP水平,改善MCAO/R大鼠神經功能損傷。miR-137抑制劑使 大鼠腦組織中miR-137、FLVCR和BCRP 表達明顯低于模型組,提示抑制miR-137能進一步抑制 FLVCR和BCRP的合成與表達,從而加重神經功能缺損情況。

4 結論

本研究結果提示,miR-137可能是診斷IS和預測腦血管不良事件發生的潛在臨床工具。miR-137可能通過促進血紅素鐵轉運蛋白FLVCR和BCRP水平,從而阻止腦組織鐵和血紅素的積累,達到保護神經元的目的。