微滴式數字PCR定量檢測禽腦脊髓炎病毒方法的建立

謝志勤,謝芝勛,張艷芳,范 晴,謝麗基,萬麗軍,羅思思,李 孟,張民秀,曾婷婷,黃嬌玲,王 盛,李 丹,韋 悠,李小鳳,任紅玉,阮志華

(廣西壯族自治區獸醫研究所 廣西獸醫生物技術重點實驗室 農業農村部中國-東盟(廣西)跨境動物疫病防控重點實驗室,廣西 南寧 530001)

禽腦脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV) 是引起雞發生急性、高度接觸性傳染病的一種常見病原之一,該病毒除感染雞外,還會引起雉雞、鵪鶉和火雞等禽類致病[1]。AEV對雞危害嚴重,尤其是雛雞,1～7日齡的雛雞感染后,病毒主要侵害雛雞的中樞神經系統,初期引起雛雞出現震顫、運動失調等癥狀,故又被稱為流行性震顫。隨著病情加重,雛雞開始行走不便,食欲減退,最后因衰竭而死亡,死亡率高達25%。AEV感染產蛋雞及種雞,雖沒有表現出明顯的神經和運動失調等癥狀,引起的死亡率也低,但對產蛋雞及種雞的產蛋量產生嚴重影響,使產蛋雞產蛋量突然下降5%～10%[2-3]。更為嚴重的是產蛋雞或種雞感染AEV后可以成為隱性帶毒者,對雞造成持續感染或潛伏危害,病毒不但可以經種蛋垂直傳播,導致雞胚孵化率、出殼率下降[4],還造成防控困難。有效防控AEV的關鍵是早診斷及早預防,實驗室方法如病毒分離鑒定[5]、PCR[6]、熒光PCR[7-9]、LAMP[10]等是診斷AEV的最準確方法,但這些方法或多或少都存在一些不足或檢測局限,尤其是對隱性帶毒及感染早期的雞中AEV載量低時的檢測,尚沒有很好的方法。

近年來,隨著微滴式數字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技術的不斷發展與完善,使得該技術在很多領域迅速得到應用[11-13]。其技術方法是將反應液通過油包水方式分為獨立的數萬個納米反應微滴,根據每個反應微滴信號逐個統計帶熒光(陽性)與未帶熒光(陰性)微滴個數與比例,并自動計算出核酸(陽性模板)的微滴數(拷貝數)來實現對核酸的絕對定量,結果更為直觀準確。由于ddPCR具有特異、敏感和準確定量的特點,對AEV隱性感染及感染早期的準確檢測成為可能。

本研究采用AEV VP1基因為靶基因,通過在靶基因保守序列中設計引物和探針,并應用合成的引物和探針研究建立ddPCR檢測AEV的方法,旨在為檢測診斷AEV提供更加準確的技術,為有效防控AEV提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 毒株AEV Van株和AEV 19株、禽偏肺病毒(acian metapneumovirus,aMPV)MN-10株由美國康涅狄格州大學MAZHAR I.KHAN教授惠贈;雞傳染性喉氣管炎病毒(avian infectious laryngotracheitis virus,ILTV)BJ株購自中國獸醫藥品監察所;雞傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)Mass 41株、禽呼腸孤病毒(avian reovirus,ARV) S1133株、雞新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株、H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 subtype avian influenza virus,H9N2 AIV)066C株均由本實驗室保存;65份病雞腦樣品分別于2020年1-12月從廣西5個雞場中采集,保存于-70℃。

1.2 主要試劑Supermix for Probe ddPCR(No dUTP,Lot:1863024)、Droplet Generation Oil for Probes ddPCR(Lot:1863005)、Droplet Reader Oil(Lot:1863004)、DG8 Cartridges(Lot:1863008)、DG8 gaskets(Lot:1863009)、Pierceable Foil Heat Seal(Lot:1814040)購自美國Bio-rad公司;EasyPure Virual DNA/RNA Kit(Lot:N20527)、Gel Extration Kit(Lot:L41118)購自北京全式金生物技術有限公司;RT-PCR(PCR)擴增試劑盒、100bp DNA Ladder、pMD18-T、大腸桿菌DH5α、T4連接試劑盒、凝膠回收試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 主要儀器微滴生成儀(QX200 Droplet Generator)、熱封儀(PX1)、微滴數字讀取儀(QX200 Droplet Reader)、梯度PCR擴增儀(T-100)購自美國Bio-rad公司;熒光 PCR 儀(quantStudio 5)、分光光度計(Nanodrop 2000)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 引物設計與合成根據GenBank中已發表的AEV VP1 基因序列(No.JQ894852.1),利用在線(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)軟件設計ddPCR特異性引物和探針,并在線對設計的引物和探針序列進行BLAST分析。在探針序列的5′端添加FAM熒光基團,3′端添加BHQ1淬滅基團。引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并進行HPLC純化,引物和探針序列見表1。

表1 引物和探針寡核苷酸序列

1.5 重組質粒標準模板的構建與鑒定將提取的AEV Van株RNA反轉錄成cDNA作為模板,然后用設計的引物APV-F/APV-R進行擴增后,將大小約160 bp條帶的電泳凝膠切下并回收純化,與pMD18-T載體連接并轉染至大腸桿菌DH5α,構建重組質粒pMD18-AEV。重組質粒經PCR鑒定后送寶生物工程(大連)有限公司進行序列測定,序列正確的重組質粒經DNA用分光光度儀測定D260 nm/D280 nm的值,并按公式計算拷貝數?？截悢?(濃度×阿伏加德羅常數)/(1個堿基對的平均分子質量×總長度)。

1.6 ddPCR反應的建立及條件優化20 μL反應體系:2×Supermix 10 μL,5.0～40.0 μmol/L的AEV-F/AEV-R引物各1 μL,2.5～40.0 μmol/L的AEV-Pro 1 μL,重組質粒經DNA 1 μL,加滅菌ddH2O補足至20 μL。微滴生成:在DG8 Cartridges的第2排孔分別加入上述反應液20 μL,第3排孔每孔加入Droplet Generation Oil 70 μL,蓋上DG8 gasket,置微滴生成儀上自動生成微滴于第1排孔。封膜:吸取生成的微滴至96孔板內,加鋁膜Pierceable Foil Heat Seal置PX1熱封儀上,程序設置為180℃ 10 s進行封膜。PCR擴增:封膜的96孔板放入PCR擴增儀上進行擴增,設計反應程序:95℃ 10 min;94℃ 30 s,退火溫度設置54～61℃ 1 min(2℃/s),共進行40個循環;98℃ 10 min,4℃結束。數據讀取及分析:反應結束后將96孔板置QX200 Droplet Reader上讀取信號并進行數據分析。

1.7 ddPCR特異性測定按EasyPure Virual DNA/RNA試劑盒說明書方法,提取AEV Van、AEV19以及H9N2 AIV、IBV、ARV、NDV、APV的RNA后反轉錄為cDNA。提取ILTV的DNA,然后分別加入已優化好的ddPCR反應體系中進行特異性檢測。

1.8 ddPCR靈敏性及重復性測定測定重組質粒DNA的濃度并作10倍遞減稀釋,取10-4～10-11共8個連續稀釋的重組質粒DNA作為模板加入到已優化的ddPCR反應中,以驗證ddPCR反應的靈敏性。用同樣的引物和探針對相同重組質粒DNA的濃度進行熒光定量PCR平行檢測,比較2種方法的反應靈敏性。取10-5～10-8共4個連續稀釋的重組質粒DNA進行4次平行試驗,分析ddPCR檢測的線性區間。取10-5～10-7共3個連續稀釋的重組質粒DNA進行3次重復試驗,以檢測ddPCR的重復性,分析檢測結果的變異情況。

1.9 臨床樣品檢測取約5 g腦樣品按1∶8加入無血清的MDEM培養基進行研磨,-70℃反復凍融3次,4 000 r/min離心5 min,取上清200 μL,按EasyPure Virual DNA/RNA Kit說明提取樣品的核酸,用建立的ddPCR方法進行檢測;同時引用文獻[9]中熒光定量PCR方法進行檢測,比較2種檢測方法的檢測效果和符合率。

2 結果

2.1 重組質粒標準模板的鑒定結果重組質粒pMD18-AEV經PCR擴增鑒定,結果擴增出大小約160 bp的明亮條帶。重組質粒pMD18-AEV送寶生物工程(大連)有限公司進行序列測定,測定的序列用MegAlign軟件與AEV VP1基因(No.JQ894852.1)序列進行Clustal W Method分析,分析結果為測定的序列與AEV VP1基因100%同源,證明插入片段序列正確。用分光光度儀測定重組質粒pMD18-AEV的D260 nm/D280 nm值為1.95,經計算質粒質量濃度為0.107 g/L,按公式計算拷貝數為6.1×108拷貝/μL。

2.2 ddPCR 反應退火溫度的優化ddPCR反應中,采用20 μmol/L的AEV-F/AEV-R引物濃度和10 μmol/L的AEV Pro濃度各1 μL(終濃度分別為1.0,0.5 μmol/L),加入模板濃度約為610拷貝/μL時,退火溫度設置為54,55,56,57,58,59,60,61℃共8個不同梯度進行ddPCR反應擴增,結果退火溫度為58℃時,陽性微滴信號(顯示為藍色)和陰性微滴信號(顯示為黑色)之間的熒光信號區分明顯,擴增獲得的陽性微滴數最高,為605拷貝/μL,綜合這些因素,確定最佳擴增的退火溫度為58℃。

2.3 ddPCR 反應引物及探針濃度的優化ddPCR反應中對不同的引物濃度和探針濃度進行優化,結果當引物AEV-F/AEV-R的終濃度分別為1.0 μmol/L,探針AEV-Pro的終濃度為0.5 μmol/L時,檢測到的陽性微滴信號最高,且陽性微滴與陰性微滴之間的熒光信號區分明顯。此時的引物和探針終濃度被確定為最佳的引物和探針濃度。

2.4 ddPCR 反應的建立及反應程序根據優化結果,ddPCR反應體系為20 μL,包含:2×Supermix10 μL,20 μmol/L AEV-F/AEV-R引物各1 μL(終濃度為1 μmol/L),10 μmol/L AEV-Pro 1 μL(終濃度為0.5 μmol/L),模板DNA/RNA 1 μL,用ddH2O補足至20 μL。反應程序:95℃ 10 min;94℃ 30 s,設置退火溫度58℃ 1 min(2℃/s),40個循環;98℃ 10 min,4℃結束。

2.5 ddPCR反應特異性測試結果提取AEV Van、19以及H9N2 AIV、IBV、ARV、NDV、APV的RNA后反轉錄為cDNA,提取ILTV的DNA,然后分別加入已優化好的ddPCR反應體系中進行特異性檢測,結果各孔擴增生成的總微滴數(包括陽性和陰性微滴)均達10 000以上,且較均衡,微滴擴增條件成立,出現陽性微滴的樣品只有AEV Van和AEV19,對照的H9N2 AIV、IBV、ARV、NDV、APV、ILTV沒有出現陽性微滴,且與AEV也沒有出現交叉反應,結果表明特異性強(圖1)。

1.AEV Van;2.AEV19;3.H9N2 AIV;4.IBV;5.ARV;6.NDV;7.APV;8.ILTV

2.6 ddPCR靈敏性測定結果取10-4～10-11共8個連續稀釋的pMD18-AEV重組質粒DNA各1 μL作為模板,分別按照優化的ddPCR和熒光定量PCR檢測,結果顯示,ddPCR對重組質粒DNA的最低檢測限為5.9拷貝/μL(10-8稀釋),而熒光定量PCR只檢測出10-7稀釋的質粒標準品(61.4拷貝/μL),結果見圖2,3。結果表明,本方法建立的ddPCR檢測敏感性比熒光定量PCR高10倍,敏感性較高。用10-5～10-8共4個連續稀釋的pMD18-AEV重組質粒DNA進行ddPCR檢測,檢測結果的拷貝數在5.9～6 150.0拷貝/μL之間,用檢測結果的陽性拷貝數對數值與對應稀釋的拷貝數的對數值繪制的絕對定量曲線,線性方程為y=-0.97x+8.68,結果為線性。由圖4可知,R2值為0.999 4,斜率為-0.97x,表明檢測結果穩定、可靠。

1～8.10-4～10-11 pMD18-AEV DNA

1～8.10-4～10-11 pMD18-AEV DNA

2.7 臨床樣品的檢測結果對65份雞腦病料樣品的檢測,ddPCR檢測結果有3份樣品為AEV陽性,檢測拷貝數為120,135,246拷貝/μL,62份樣品為AEV陰性,陽性檢出率為4.62%(3/65),與qPCR檢測的結果一致。部分樣品檢測結果見圖5,表2。

圖4 AEV ddPCR標準曲線

1.pMD18-AEV重組質粒(陽性對照);2.SPF雞腦樣品(陰性對照);3.腦樣品3(+);4.腦樣品5(-);5.腦樣品16(+);6.腦樣品18(-); 7.腦樣品31(+);8.腦樣品35(-);9.腦樣品38(-);10.腦樣品40(-);11.腦樣品42(-);12.腦樣品45(-);13.腦樣品48(-);14.腦樣品50(-);15.腦樣品55(-);16.腦樣品65(-)

3 討論

AEV感染可引起包括雞、雉雞、鵪鶉和火雞等家禽致病,特別是對1周齡以內的雛雞危害特別嚴重,除了引發雛雞出現震顫、運動失調等癥狀外,嚴重時還會導致雛雞大批死亡。AEV感染產蛋雞和種雞時雖不會引起大批死亡,但也會導致產蛋量下降,種胚孵化率降低。及時準確診斷是防控AEV的關鍵手段之一,常規的實驗室診斷方法如原分離鑒定診斷周期長、技術要求高而達不到快速診斷的目的。普通PCR方法較分離鑒定具有較好的特異性和敏感性,但也不夠敏感,存在漏檢現象。熒光定量PCR方法比普通PCR方法敏感性高,但對一些病毒載量較低如感染早期或隱性感染時期的樣品,也存在檢測的局限性而檢測不到病原,且不能進行絕對定量。在這種情況下,需要找到一種更敏感的檢測方法才能滿足臨床樣品檢測的要求。本研究建立的ddPCR檢測AEV方法,是在AEV VP1基因序列上設計引物和探針,通過對引物探針濃度及反應條件等進行優化后而建立的一種方法,經特異性檢測驗證,本方法只檢出AEV,沒有檢出常見的多種禽病病原,且與禽病病原無交叉反應,特異性好。靈敏性檢測表明最低檢測限為5.9拷貝/μL,ddPCR方法比熒光定量PCR方法靈敏性高10倍,與劉洋等[14]報道的ddPCR方法比熒光定量PCR方法靈敏10倍的結果一致,敏感性好。因此,本方法的建立及應用,對AEV的及早診斷,及早做好相應預防,降低由AEV感染引起的發病率和死亡率均有重要意義。

表2 65份臨床樣品檢測結果

本研究中引物和探針濃度是直接影響敏感性檢測的關鍵因素,為了獲得更好和更敏感的擴增效果,需要對引物和探針濃度進行優化。經優化發現引物終濃度為1.0 μmol/L,探針終濃度為0.5 μmol/L的情況下,即引物與探針濃度比為2∶1時,ddPCR擴增反應獲得的AEV陽性微滴信號(藍色)最高,且陽性微滴與陰性微滴之間區分明顯,反應具有最低的負熒光幅度,敏感性也高。同時,該方法通過對4個連續稀釋的pMD18-AEV重組質粒DNA進行檢測,用檢測結果的陽性拷貝數對數值與對應稀釋的拷貝數的對數值繪制的絕對定量曲線,結果為線性。進一步說明本研究建立的方法穩定好,結果可靠,為ddPCR方法的臨床應用提供可靠技術。

ddPCR方法從出現至今,由于其具有較高的靈敏性和絕對定量,使得該技術在各領域得到廣泛應用與發展,在動物疫病檢測方面已發揮了重要作用[15-17]。目前制約該技術應用發展的主要問題是儀器設備及試劑昂貴,隨著技術的進步以及ddPCR儀器、試劑國產化的普及,相信在不久的將來,檢測成本有望大幅度降低,操作也會進一步簡單化。

綜上所述,本方法具有特異性好、靈敏性高和絕對定量的特點,能滿足臨床對病毒載量較低的樣品的檢測,為及時準確絕對定量檢測AEV提供技術支撐,對有效防控AEV感染有重要現實意義。