關嶺牛MEF2C基因克隆與差異表達性分析

孫金魁,許厚強*,黃 勇,李 永,熊 訊

(1.貴州大學 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室/貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室,貴州 貴陽 550025;2.貴州大學 動物科學學院,貴州 貴陽 550025;3.貴州大學 生命科學學院,貴州 貴陽 550025)

關嶺牛是貴州省著名黃牛品種,產于南北盤江流域滇、桂、黔相鄰的廣大山區,其中以中心產區的關嶺縣最為著名,主要位于云貴高原南部及其邊緣地帶[1]。得益于優質的生態環境形成了關嶺牛獨特的品種特性,關嶺牛具有肢蹄強健、體質強壯、短小精悍、耐粗飼抗病力強等優良特性,對當地生態條件具有非常強的適應性,其自身攜帶的獨特基因是生物多樣性的重要組成部分[2],是中國較為寶貴的家畜品種遺傳資源。

肌細胞增強因子-2(myocyte enhancer factor 2,MEF2)屬于轉錄調節因子MADS-Box家族,定位于細胞核內,通過調節肌肉特異基因的表達影響骨骼肌發育分化。該家族包括微小染色體維持蛋白(minichromosome main-tenance protein 1,MCM1)、AGAMOUS、DEFICIENS和血清反應因子(SRF)等成員[3]。MEF2蛋白最初在發育中的骨骼肌肌管中被發現,具有DNA結合活性,具備結合肌肉肌酸激酶(MCK)基因啟動子中富含A/T的DNA序列的能力[4]。前期研究中,MEF2被證實在線蟲與果蠅中為單基因,MEF2基因家族在脊椎動物中含有4個亞基,分別包括MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D,家族成員結構相似,皆含有中心MEF2結構域,N端結合DNA的MADS區域和C端轉錄激活區域,在其N端都含有MADS-box保守結構,MEF2基因在行使其功能時,主要通過MADS-box結構域和MEF2結構域與其他轉錄輔因子的相互作用來調控其下游靶基因的轉錄活性,具備調控細胞凋亡,包括神經元、肌肉、血管、淋巴細胞和骨骼在內的多種組織的分化、形態發生和維持的作用[5]。MEF2的DNA結合位點是一段偏保守的序列,該序列在肌肉組織特異性表達基因的調控區大量存在,具有調控動物胚胎期肌肉發育的功能[6]。

MEF2C基因是MEF2家族在骨骼肌發育過程中最早表達的的成員,可將該基因視作信號轉錄開關,作為很多上游信號的積分器進而發揮功能。在成肌細胞分化過程中,該基因作為肌肉特異性基因的轉錄因子發揮作用,與神經元的終末分化和有絲分裂后存活相關[7];在機體大多數組織中均有表達,屬于廣譜表達基因[8],還參與調控正常神經發生、骨轉換和內皮細胞血管生成以及誘導細胞增殖分化的過程,在早期神經元的分化與大腦皮層的分布發揮重要作用[9-12]。MEF2C基因與機體發育聯系密切,可在體內影響多巴胺的神經元分化調控,ADRIO等[13]研究發現MEF2C基因參與了額顳葉變性(frontal variant of frontotemporal lobe degeneration,fv-FTLD)癲癇發作。目前MEF2C基因的研究已在豬、鴨子、華貴櫛孔扇貝和牦牛等物種中進行了報道[14-17],有關MEF2C基因在關嶺牛中的研究鮮有報道。因此,本試驗以關嶺牛為試驗對象,探究MEF2C基因在不同時期關嶺牛以及雜交牛組織器官中的表達特征和生物信息學特性,為今后進一步改善關嶺牛產肉性能和進行良種選育,挖掘種質資源提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 動物于貴州省安順市西秀區幺鋪鎮屠宰場選取關嶺牛和犢牛以及雜交牛(梨木贊?！陵P嶺牛)各3頭,采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、前腿肌、后腿肌、背最長肌7個組織,用生理鹽水(0.9%NaCl)、DEPC水(0.1%焦碳酸二乙酯)進行處理,置于-80℃冰柜保存,用于各組織器官的總RNA提取。

1.2 試劑與儀器TRIzol試劑購自英駿生物技術有限公司(Gibco,美國),SYBR Green qPCR Master Mix、逆轉錄試劑盒均購自MCE公司(美國),2×Es Taq Master Mix、無水乙醇、異丙醇、丙三醇、DEPC水均購自康為世紀生物科技有限公司(Life technologies,北京),DM5000 Marker購自擎科生物技術有限公司(北京),超微量紫外分光光度計,購自美國Thermo Fisher公司;多功能梯度擴PCR儀(型號為ABIVeritiTM,德國),實時熒光定量PCR儀;臺式高速冷凍離心機。PCR擴增儀(C1000 TouchTM)、凝膠成像系統(Uni-versal Hood Ⅱ),均購自美國BIO-RAD有限公司。

1.3 組織總RNA提取取組織樣品放入研缽內,加入適量液氮碾磨,待組織被磨成粉末狀即可,轉移至1.5 mL離心管中,采用TRIzol法提取關嶺牛各組織的總RNA,測定總RNA的濃度和純度,置于-80℃冰柜冷藏備用。

1.4 cDNA第一鏈合成在PCR管中加入5×gDNA Remover Reaction Mix,gDNA Remover,組織RNA和DEPC-ddH2O,混勻并短暫離心,37℃放置5 min;隨即加入2×RT Recation MIX(with primer),StarScript Ⅱ RT MIX 1 μL,DEPC-ddH2O,再次混勻離心,42℃孵育15 min,85℃加熱5 min,后置于-20℃冰箱保存。

1.5 引物設計與合成參考NCBI數據庫中的MEF2C(GenBank登錄號NM_001046113.1)的mRNA序列,使用Primer Premier 5.0設計擴增引物和熒光表達引物(表1),將設計好的引物與內參引物GAPDH(牛)送至擎科生物技術有限公司(北京)進行合成。

表1 引物序列信息

1.6 基因克隆與測序分析PCR擴增反應程序為94℃ 5 min預變性;94℃ 10 s變性,62℃ 20 s退火,72℃ 30 s延伸,共35個循環;72℃終延伸5 min。產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。目的片段與pMD-19T載體連接,連接產物轉化到DH5α感受態細胞中,挑選單克隆菌落培養,進行菌液PCR鑒定。篩選所需的陽性菌液送至重慶擎科生物技術有限公司(北京)測序。

1.7 生物信息學分析運用生物信息學在線分析軟件(表2)對牛MEF2C基因編碼蛋白的理化性質、親疏水性、亞細胞定位、跨膜結構域、蛋白網絡預測、二級和三級結構及磷酸化位點進行分析。在NCBI上查詢其他10個物種MEF2C基因核苷酸序列,使用MEGA7.0軟件進行同源性比對,構建系統進化樹。

表2 預測分析網址軟件

2 結果

2.1 牛MEF2C基因CDS區克隆與測序電泳檢測發現在1 000～2 000 bp之間顯現出單一明亮的條帶(圖1A),與預期片段大小一致,將膠回收產物和PMD-19T載體以及Soution Ⅰ離心混勻,16℃金屬浴過夜連接。菌液PCR驗證結果顯示在1 326 bp附近有1條明亮條帶(圖1B),與預期結果相符。

2.2 牛MEF2C蛋白理化特性分析牛MEF2C基因的mRNA序列為2 770 bp(NM_001046113.1),ORF(開放閱讀框)為1 326 bp,編碼441個氨基酸,5′非編碼區長為383 bp,3′非編碼區長為1 059 bp;MEF2C蛋白理化特性分析結果表明MEF2C基因蛋白總原子數為6 632,分子式為C2053H3281N607O671S2,理論等電點為7.71,相對分子質量約為48 kDa;不穩定系數為51.07。氨基酸中組成含量最高的是絲氨酸(13.60%)、組成含量最低是色氨酸(0.50%);43個帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)、44個帶負電荷的氨基酸殘基量(Asp+Glu);脂肪族系數是67.87;總平均親水性是-0.640。利用PSORT Prediction對牛MEF2C基因編碼產物亞細胞結構預測分析,結果顯示其主要定位于為細胞核(60.90%),其次為細胞質(21.70%)、線粒體(13.00%)和細胞骨架(4.30%)。

A.MEF2C基因CDS區擴增圖(M.DL5000 DNA Marker; 1～3.MEF2C基因CDS區擴增產物);B.MEF2C基因菌液PCR鑒定圖(M.DL5000 DNA Marker;1～3.MEF2C基因CDS區菌液PCR產物)

2.3 MEF2C蛋白二級和三級結構預測SOPMA和SWISS-MODEL對MEF2C蛋白二級和三級結構分析預測,在MEF2C蛋白中,無規則卷曲(67.80%)占比最大,其次為α-螺旋(17.69%)、延伸鏈(10.88%)以及β-折疊(3.63%)(圖2)。通過預測三級結構模型(圖3)得知MEF2C蛋白主要由α-螺旋、無規卷曲和延長鏈在空間上通過折疊組成,與其二級結構預測結果基本吻合。

圖2 牛MEF2C蛋白二級結構預測分析

圖3 牛MEF2C蛋白三級結構預測分析

2.4 MEF2C蛋白結構域與親疏水性預測SMART軟件對MEF2C蛋白功能結構域進行預測,結果顯示(圖4),在MEF2C蛋白氨基酸序列的1～60位有1個MADS功能結構域,E值=3.29e-37。在324～334位、387～403位之間各存在1個低復雜區域(low complexity)。ProtScale軟件對親疏水性預測,結果(圖5)所示,MEF2C蛋白的最高分值是1.933,疏水性最強;最低分值是-3.389,親水性最強。

圖4 牛MEF2C蛋白功能結構域預測

2.5 MEF2C基因磷酸化位點和跨膜結構域預測分析NetPhs 3.1 Server對MEF2C蛋白磷酸化位點進行預測,結果表明牛MEF2C蛋白共有98個磷酸化位點,絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)的數量分別為60,26和12個(圖6)。利用TMHMM軟件對牛MFE2C蛋白跨膜結構域進行預測分析(圖7),結果表明MEF2C蛋白大多處于膜外,小部分置于膜內,即MEF2C蛋白有跨膜結構域,是膜蛋白。

圖5 牛MEF2C基因親疏水性預測分析

2.6 MEF2C基因氨基酸序列同源性分析和遺傳進化樹構建NCBI上查找10個不同物種的MEF2C基因核苷酸序列,利用Megalign軟件對關嶺牛(Bostaurus,NP_001039578.1)和牦牛(Bosmutus,XP_005905875.1)、水牛(Bubalusbubalis,XP_0448-03251.1)、山羊(Caprahircus,XP_005683480)等10個不同物種的MEF2C基因氨基酸序列進行同源相似性分析。結果(圖8)顯示,關嶺牛MEF2C氨基酸序列與牦牛、水牛和駱駝的氨基酸序列同源性為99.8%,與大象和火雞氨基酸序列同源性較低,分別為27.8%和10.4%。使用MEGA7.0軟件構建MEF2C基因遺傳進化樹并計算遺傳距離;與NCBI中登錄的牦牛(Bosmutus,XM_005905813.2)、火雞(Meleagrisgallopavo,XM_031557439.1)等10個物種的基因序列進行比對,構建遺傳進化樹。結果(圖9)顯示,關嶺牛MEF2C基因與牦牛和水牛的遺傳距離較近,與火雞的遺傳距離較遠;表明MEF2C基因在物種中體現出一定的遺傳保守性。

圖6 牛MEF2C蛋白磷酸化位點預測結果

圖7 牛MEF2C蛋白跨膜結構域預測結果

圖8 不同物種MEF2C蛋白氨基酸序列同源性比對分析

2.7 牛MEF2C蛋白互作網絡預測利用STRING預測牛MEF2C蛋白互作網絡圖譜,結果(圖10)所示,包含與酵母Hda1(histone deacetylase-1)蛋白高度同源的Ⅱa類HDAC家族成員,組蛋白去乙酰化酶(HDAC)家族蛋白成員HDAC4和HDAC5;參與核心組蛋白(H2A、H2B、H3和H4)N末端部分賴氨酸殘基的去乙酰化,去乙酰化其他蛋白質分子或與其他蛋白形成復合物[18],并在轉錄調控、細胞周期進程和發育中發揮重要作用。絲裂原蛋白活化激酶(MAPK)家族蛋白成員MAPK11、MAPK12、MAPK13與MAPK14,通過激活環中TGY基序的雙重磷酸化發揮功效[19],參與細胞分化與生長凋亡,在細胞反應級聯中起重要作用,以及參與心肌發育和成肌細胞分化的GATA4、MYOD1、PTK2、NKX2-5等相關蛋白。MEF2C在整個蛋白互作網絡中具有控制心臟形態發生和肌肉生成、參與血管發育、調節基礎和誘發的突觸傳遞以及參與神經發生和皮質結構的發育等分子功能,與各互作蛋白共同發揮功能,參與生肌細胞生長發育等生理過程。

2.8 MEF2C基因在牛不同組織中的表達量實時熒光定量PCR結果顯示,MEF2C基因在關嶺牛和雜交牛的7個組織中皆有表達。以脾臟作為對照組,GAPDH為內參基因。結果(圖11)所示,關嶺牛與雜交牛在肺臟中的表達呈極顯著性差異(P<0.01),在心臟、脾臟、肝臟和背最長肌中的表達呈顯著性差異(P<0.05),在前腿肌和后腿肌中表達量差異不顯著(P>0.05)。通過對關嶺牛在犢牛階段和成年牛階段的7個不同組織器官進行分析(圖12),MEF2C基因在犢牛和成年牛的7個組織中表達量差異均極顯著(P<0.01),心臟和脾臟在成年牛階段表達量極顯著高于犢牛階段(P<0.01),其他5個組織中在犢牛階段的表達量極顯著高于成年牛階段。MEF2C基因在關嶺牛犢牛階段不同組織間的表達特征(圖13A)所示,該基因在肺臟中表達量極顯著高于其他組織,表達量從高到低依次是肺臟、脾臟、肝臟、前腿肌、心臟、背最長肌和后腿肌。MEF2C基因在關嶺牛成年牛的脾臟中表達量極顯著高于其他組織(圖13B),MEF2C基因表達量從高到低順序依次是脾臟、心臟、肺臟、肝臟、前腿肌、后腿肌和背最長肌。同時,進一步研究發現MEF2C基因在牛成肌細胞分化過程的表達量與細胞分化時間呈正相關。MEF2C基因在0,12,24,48 h的表達量呈上升的趨勢(圖14),不同時間段的表達量差異極顯著(P<0.01),表明MEF2C基因在成肌細胞分化過程中有著至關重要的作用。

圖9 牛MEF2C基因系統進化樹

圖10 牛MEF2C蛋白互作網絡預測分析

*.P<0.05;**.P<0.01

*.P<0.05;**.P<0.01

A.MEF2C基因在犢牛不同組織器官中的表達差異;B.MEF2C基因在成年牛不同組織器官中的表達差異;圖柱上不同小寫字母a、b、c、d、e表示各組織表達量差異顯著(P<0.05);圖柱上不同大寫字母A、B、C、D表示各組織表達量差異極顯著(P<0.01)。下同

圖14 MEF2C基因在牛成肌細胞分化過程中的表達差異及生長趨勢

3 討論

MEF2在骨骼肌、心肌和平滑肌的肌生成中起重要作用,對肌肉分化至關重要[20]。MEF2本身并不具備肌源性活性,但與bHLH(basic helix-loop-helix)蛋白家族共同發揮作用時,可驅動并放大肌源性分化程序[21]。MEF2蛋白N端具備結合DNA功能的MADS區域和中心MEF2結構域,C端為轉錄激活區域,該區域在MEF2基因家族成員及不同物種間的保守性較低且序列多變,含有多種可變剪接方式,以進一步調控MEF2蛋白活性[22-24]。MEF2主要通過CaMK-HDACs(Ca2+-鈣調素依賴的蛋白激酶-組蛋白去乙?；?、calcineurin(鈣調磷酸酶)和MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)3種信號通路發揮作用[25]。MEF2基因大多通過MADS-box結構域和中心MEF2結構域與其他轉錄輔因子相結合來發揮作用,家族成員與許多參與肌肉生長和發育的基因相結合,以啟動或加強肌源性基因的表達[26-28],通過控制下游靶基因的轉錄活性來調控細胞的分裂、分化和凋亡的過程。目前已證實牛MEF2C基因被定位于7號染色體[29],MEF2C作為廣譜表達基因,該基因結構由N端的MADS-box位點和鄰近的MEF2位點、中間的2個轉錄活性位點TAD1和TAD2與C端的選擇性剪切位點三部分組成[30]。MEF2C基因對骨骼和骨骼肌的發育至關重要,在心血管與神經細胞發育方面發揮調功能[31-32]。LIU等[33]研究發現,在肌肉受到損傷的小鼠中,同時敲除MEF2A、MEF2C和MEF2D后,肌肉修復過程受到顯著抑制,成肌細胞分化過程受到嚴重阻礙。同時,有研究表明MEF2C在神經中樞系統發育和治療癲癇等方面有著重要作用[34-35]。

本試驗成功擴增出關嶺牛MEF2C基因CDS區序列,對比NCBI中的基因序列,尚未發現核苷酸突變位點。關嶺牛MEF2C基因與其他10個不同物種的氨基酸序列進行比對分析,結果表明MEF2C基因在不同物種間存在一定的差異,說明該基因在結構和功能上具有物種和品種特異性,可能與MEF2蛋白C末端在不同物種間的保守性偏低相關[36]。MEF2C蛋白理化特性分析結果顯示MEF2C基因編碼441個氨基酸,相對分子質量約為48 kDa,為堿性不穩定蛋白。蛋白二級結構以無規則卷曲(67.80%)與α-螺旋(17.69%)為主,GRAVY值預測親疏水性發現MEF2C具有較強的親水性,有利于其在細胞內發揮作用。MEF2C在其氨基酸序列第1～60號位預測到1個MADS結構域,MADS結構域又被稱作DNA結合區,具備與DNA結合和二聚化的功能,其主要DNA結合元件是2個雙親性α-螺旋的反平行卷曲螺旋,每個亞單位1個;DNA纏繞在卷曲的螺旋周圍,使螺旋的N末端適合DNA大溝[37]。從螺旋N-末端延伸的鏈到達DNA主鏈上方并穿入小溝;1個4鏈的反平行β折疊緊靠著DNA對面的卷曲螺旋面,是二聚化界面的中心成分,MADS-box結構域通常與K-box區域相關。MEF2C基因在信號通路中發揮中心調控因子的作用,擁有多個與肌肉發育相關的互作因子,通過與其他蛋白互作進而調控信號傳導,與董晨等[38]研究結果相似。

MEF2C基因在關嶺牛和雜交牛各組織器官中均有表達,同一組織在不同牛種之間和同一牛種的不同組織之間的表達程度存在一定的差異性,且在關嶺牛不同發育階段的表達程度存在差異性,說明MEF2C基因屬于廣譜表達基因。該基因在關嶺牛和雜交牛內臟器官中的表達量差異顯著,在肌肉中的表達量差異不顯著,該結果可為關嶺牛良種選育和遺傳標記提供數據參考。通過對比MEF2C基因在關嶺牛犢牛階段和成年階段各組織器官表達量可知,MEF2C基因在成年牛脾臟和心臟中的表達量極顯著高于犢牛,說明MEF2C基因與心肌生長發育關系密切[39]。研究表明,MEF2C基因可作為心臟基因的重要轉錄調節因子,MEF2C功能受到影響將導致心臟疾病的發生[40];而在其他組織中的表達量要極顯著低于犢牛,與王興東等[17]、朱弘焱等[14]和展召陽等[41]研究結果相似,MEF2C基因在機體不同年齡段中皆可表達,且表達量差異顯著,表達量隨年齡增長呈負相關,可能與機體肌肉組織達到相應階段后的發育遲緩有關。同時研究發現MEF2C基因對牛成肌細胞分化有著重要作用。本試驗結果表明MEF2C基因在關嶺牛不同組織器官的生長發育和成肌細胞的分化有一定作用,但未在蛋白水平做深入研究,后期可從蛋白方面對MEF2C做深層研究。本試驗進一步完善了MEF2C基因對關嶺牛生長發育的影響,為探究地方優質種質資源提供了理論參考。