李小鳳,謝芝勛,阮志華,范 晴,謝志勤,武曉倩,韋 悠,張民秀,李 丹,萬麗軍,李 孟

(廣西壯族自治區獸醫研究所,廣西獸醫生物技術重點實驗室/農業農村部中國(廣西)-東盟跨境動物疫病防控重點實驗室,廣西 南寧 530001)

血清4型禽腺病毒(fowl adenovirus serotype 4,FADV-4)是一種無囊膜的雙鏈DNA病毒,主要感染3～6周齡肉雞,誘發心包積液肝炎綜合征(hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)[1],其發病迅猛,傳播途徑廣,致死率高,制約著我國家禽業的發展[2]。

FADV-4病毒可以入侵雞大部分器官,但病變主要發生在心臟、肝臟、腎臟,并誘發嚴重的炎癥反應,導致細胞凋亡,組織壞死[3-4]。關于FADV-4致病機制研究較少。當病毒入侵宿主時,宿主的天然免疫系統其特有的模式識別受體(patterns recognition receptors,PPRS)識別病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAM-Ps),觸發細胞內信號級聯反應,誘導Ⅰ型干擾素(INF)、細胞因子產生建立防護屏障保護宿主[5-6]。DNA模式識別受體是一種新型模式識別受體,其中一種是由環鳥苷-腺苷二磷酸合成酶(cGAS)/干擾素刺激基因(STING)介導,識別病毒雙鏈DNA(dsDNA)[7]。當病毒入侵機體時,cGAS結合病毒dsDNA,激活干擾素刺激基因STING[8-9]。STING蛋白構像發生變化,結合2′,3′-cGAMP,招募TANK連接酶(TBK1)[10-11],使TBK1磷酸化,為干擾素調節因子7(IRF7)提供結合平臺,促使Ⅰ干擾素和細胞因子表達,從而抑制病毒復制[12]。FADV-4感染LMH細胞,由STING依賴的干擾素及細胞因子變化情況還不明確。監測FADV-4感染LMH細胞病毒后不同時間點STING介導信號通路識別受體及其下游干擾素、細胞因子轉錄水平動態變化,分析其變化規律,進一步了解FADV-4的致病機制和免疫機理。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞FADV-4與雞肝癌細胞(LMH)均由廣西壯族自治區獸醫研究所生物技術重點實驗室保存。

1.2 主要試劑DMEM/F12細胞培養基(批號:8122171)、胎牛血清(FBS,批號:WXBD8944V),購自美國賽默飛世爾科技公司;Universal Genomic DNA Kit(批號:18221),購自北京康為世紀生物科技公司;Gene JET RNA Purification Kit(批號:00968689)、2×SYBR Green Master Mix(批號:91302107),購自美國英杰生命技術公司;Prime Script RT Master Mix(批號:AL12412A),購自寶日醫生物技術(北京)公司產品。

1.3 主要儀器超微量分光光度計(型號為NanoDrop2000)、實時熒光定量PCR儀(型號為Quant Studio 5),購自美國賽默飛世爾科技公司產品;倒置熒光顯微鏡(型號為ECLIPSETi2-U),購自日本Nikon公司。

1.4 FADV-4感染LMH細胞及樣品收集LMH細胞按1×106個/mL接種于6孔細胞培養板,培養24 h,棄掉培養基,接種FAdV-4病毒液稀釋液(1∶500)0.5 mL,對照組接種等量的PBS,作用1～2 h,后每孔補加1.5 mL的培養基。以24 h為1個時間點,每個時間點觀察細胞病變情況并收集細胞樣品,連續培養至120 h。

1.5 LMH細胞的病毒載量測定參照Universal Genomic DNA Kit的抽提試劑盒提供的方法進行病毒DNA抽提,NanoDrop2000測定質量濃度后將病毒DNA定量為100 mg/L,進行絕對實時熒光定量PCR,擴增體系(總體積為20 μL):2×SYBR Green Mix 10 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL(引物信息見表1 FADV-4),DNA模板 2 μL,RNasefree水6 μL。擴增程序:50℃激活2 min,95℃預變性2 min,95℃變性15 s,60℃退火1 min,60℃延伸1 min,共40個循環。每個樣品重復3次。結果按照前期實驗室建立的標準曲線計算[13]。

1.6 STING依賴的干擾素及細胞因子表達量的測定參照Gene JET RNA Purification Kit抽提試劑盒說明書進行RNA抽提,超微量分光光度計測定濃度,進行一步法反轉錄,反轉錄反應體系(總體積為20 μL):5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL,RNA 1 μg,無核酸酶水補至20 μL。反轉錄反應程序:37℃ 15 min,85℃ 5 s。以得到的cDNA稀釋10倍后作為模板進行相對實時熒光定量PCR,實時熒光定量PCR擴增體系和程序同1.5所述。檢測STING、TBK1、IRF7、INF-α、INF-β、IL-6、IL-8、IL-1β的轉錄水平,以β-actin為內參基因,引物信息見表1[14]。

1.7 數據的統計分析將獲得的FADV-4基因的擴增循環數值(Ct)后,代入已建好的標準曲線,計算細胞內病毒拷貝數。通過將獲得的試驗組與對照組目的基因,β-actin的Ct值,代入2-ΔΔCt公式計算相對轉錄水平,計算公示為:△Ct(試驗組)=Ct(試驗組目的基因)-Ct(試驗組內參基因);△Ct(對照組)=Ct(對照組目的基因)-Ct(對照組內參基因),△△Ct=△Ct(試驗組)-△Ct(對照組),表達量的差異倍數使用2-ΔΔCt。利用IBM SPSS Statistics 2.0軟件對數據進行Studentt差異性分析,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著P<0.01。采用Prism8軟件制圖。

表1 熒光定量PCR引物序列

2 結果

2.1 FAdV-4感染LMH細胞后病變和病毒復制情況FAdV-4感染LMH細胞,24 h后初露病變跡象,48 h后小部分細胞變圓、變亮;72 h后細胞聚集,間隙增大,病變較為明顯;96～120 h細胞出現大量脫落、破裂、死亡,細胞內部有被侵蝕現象(圖1)。為明確LMH細胞中FAdV-4病毒復制情況,采用實時熒光定量PCR測定不同時間點的病毒拷貝數,結果發現,FAdV-4病毒感染LMH細胞后,病毒拷貝數整體趨勢是先增加后減少,在48 h前快速增加,72 h達到最大值,拷貝數為9.13×1010copies/μL,96～120 h出現下降趨勢(圖2)。

圖1 FADV-4感染LMH細胞的病變圖片(×100 μm )

圖2 FADV-4感染LMH細胞后不同時間點的病毒載量

2.2 FAdV-4感染LMH細胞后STING依賴的干擾素及細胞因子表達量動態變化為了明確FAdV-4感染LMH細胞后STING依賴的干擾素及細胞因子表達量動態變化。實時熒光定量PCR方法測定STING、TBK1、IRF7、INF-α、INF-β、IL-6、IL-8、IL-1β在不同時間點的表達量。以未接毒組為對照組,β-actin為內參基因,所測定的這8種基因表達量呈現規律性變化。STING感染后表達量與對照組的相比,24 h先出現下調,之后上調,72 h 顯著上調(P<0.05),96～120 h極顯著上調,在96 h達到上調高峰(19.23倍,P<0.01)(圖3A)。TBK1感染后表達量與對照組的相比,24～48 h顯著上調(P<0.05),72 h輕微下調,隨后持續下調,96～120 h顯著下調(P<0.05),趨于平穩(圖3B)。IRF7感染后表達量與對照組相比,24 h先上調,48 h 反而輕微下調,72～120 h后持續上調,在96～120 h 出現極顯著上調且在120 h達到上調高峰(12.02倍,P<0.01)(圖3C)。Ⅰ型干擾素INF-α、INF-β和細胞因子IL-6、IL-8感染后表達量與對照組的相比,均呈現較大幅度的上調。INF-α表達量在24～120 h連續上調,在72～120 h極顯著上調(P<0.01),到120 h上調44.30倍(P<0.01)(圖3D)。INF-β表達量變化趨勢是先上升后下降,96 h 達到上調高峰(63.85倍,P<0.01)(圖3E)。IL-6表達量變化趨勢與INF-α的相似,在所檢測時間點連續上調,在96～120 h極顯著上調(P<0.01),120 h上調達到89.23倍(P<0.01)(圖3F)。IL-8表達量在24～96 h 持續上調,72～120 h達到極顯著上調(P<0.01),96 h出現峰值(75.34倍,P<0.01),120 h出現下調趨勢(圖3G)。炎癥因子IL-1β表達量在感染24～72 h降低(P<0.05),72～120 h有升高趨勢,這可能是降低LMH細胞受FADV-4傷害的一種方式(圖3H)。

*.差異顯著(P<0.05);**.差異極顯著(P<0.01)

3 討論

天然免疫細胞的模式識別受體特異性識別病原體,促進干擾素和細胞因子表達,誘發一系列“自我防衛”,其中STING介導的信號通路是抗病毒的重要環節之一。FAdV-4不僅感染肉雞、蛋雞、種雞[15-16],且在鴨子、鵝,鴿子、鴛鴦等動物發現[17-19],其病程短、致死率高,造成養殖業巨大的經濟損失。因此,監測FAdV-4感染LMH細胞后STING依賴的干擾素及細胞因子表達量動態變化,為進一步研究FADV-4致病機制奠定試驗基礎。結果表明,STING、TBK1、IRF7、INF-α、INF-β、IL-6、IL-8的表達量均出現不同程度的上調,干擾素INF-α、INF-β及細胞因子IL-6、IL-8的表達量上調較為顯著。提示STING-TBK1-IRF7介導的信號通路受體誘導Ⅰ型干擾素和細胞因子表達,在應答FADV-4感染LMH細胞中發揮重要作用。

STING是DNA信號通路的一個關鍵接頭蛋白,位于內質網,在免疫系統作為樞紐蛋白,發揮信號傳遞,啟動天然免疫功能[20-21]。已有研究表明,當病原體核酸暴露于細胞質,STING被激活,形成二聚體,開始膜運輸,經過高爾基體最終到達細胞核周圍,其C端尾部(CTT)打開呈線性化,連接TBK1,同時TBK1被磷酸化,并為IRF7提供結合平臺,使其磷酸化,激活下游的干擾素和炎性因子上調表達。本試驗中,通過實時熒光定量PCR技術分析發現,FADV-4感染LMH細胞后,STING、TBK1、IRF7表達量出現不同程度的上調。STING在感染24 h出現輕微下調,后上調,在96 h達到19.23倍(P<0.01),分析STING表達量在24 h下調原因可能是LMH細胞天然免疫系統識別到FADV-4的入侵時被活化,形成二聚體,之后表達量上調,在72 h顯著上調,此時的FADV-4的病毒達到增殖高峰(9.13×1010copies/μL),96～120 h病毒載量出現下降趨勢,病毒復制拷貝數從9.13×1010copies/μL下降到9.03×1010copies/μL,STING的轉錄水平維持在一個較高水平,表明STING與病毒復制有一定正相關性。TBK1的轉錄水平在感染24～48 h 顯著上調,72 h輕微下調,保持在一個相對穩定的數值,分析下調原因可能是當天然免疫系統被激活時,TBK1被STING磷酸化,其以磷酸化形式(PTBK1)存在。IRF7表達量在感染后,先上調后下調,再持續上調,在120 h出現峰值,暗示隨著FADV-4快速增殖,IRF7開始與FADV-4病毒作較量,抑制病毒復制。STING、IRF7表達量平升高與LI[22]在感染FADV-4的雞身上研究的結果一致。以上提示,STING介導的信號通路受體在FADV-4感染LMH細胞后,48 h前可能是識別過程,隨著感染時間延長病毒復制拷貝數增加,STING-TBK1-IRF7介導的信號通路積極參與調控LMH細胞的免疫應答。

STING介導的信號通路誘導細胞因子和Ⅰ型干擾素表達抗病毒已經得到證實。INF-α、INF-β屬于常見的Ⅰ型干擾素,是免疫調節和抗病毒感染的重要因子。INF-α和INF-β在感染后72 h劇烈上調,INF-α在120 h出現峰值(44.30倍),INF-β在感染后96 h達到上調高峰(63.85倍)。IL-6是一種典型的功能性多效性細胞因子,在宿主防御中發揮重要作用。當感染或組織損傷發生時,IL-6由單核細胞和巨噬細胞迅速產生,有幫助清除感染因子和修復受損組織作用[23]。IL-8是趨化因子家族的成員,介導局部炎癥有關的免疫應答輔助抗體生成。IL-6、IL-8表達量在感染72 h后與對照組的相比出現劇烈的上調,上調高峰分別為89.23,75.34倍,研究結果與NIU等[24]的研究一致。FADV-4感染LMH細胞后,病毒在48 h前快速復制,72 h病毒復制拷貝數最高,INF-α、INF-β、IL-6、IL-8在感染后24～72 h呈上升趨勢,在72 h時上升倍數從高到低分別為IL-8(32.80倍)、INF-β(19.76倍)、IL-6(15.52倍)、INF-α(14.84倍)。表明IL-8是抗感染的主要免疫因子。72 h正是病毒感染的高峰期,病毒迅速入侵細胞內部,侵害細胞,使細胞聚集,間隙增大,破裂,導致細胞對營養物質吸收降低,進而導致細胞死亡。96～120 h期間,FADV-4在LMH細胞中呈下降趨勢,大量細胞死亡。INF-α、IL-6依然處于上升趨勢,INF-β、IL-8呈現下降趨勢,在120 h時,INF-α、INF-β、IL-6、IL-8表達量從高到低分別為IL-6(89.23)、IL-8(57.38)、INF-α(44.30)、INF-β(42.60)。表明在感染后期,IL-6是主要的抗感染的細胞因子,這與其幫助清除感染因子和修復受損組織作用相一致[23]。猜測FADV-4的病毒載量下降原因有2個:一是INF-α、INF-β、IL-6、IL-8起到了抗病毒復制的作用;二是LMH細胞在感染后期,細胞大量死亡病毒失去了宿主,失去營養物質的來源,導致下降。這有待進一步研究。炎癥因子IL-1β感染后先降低后升高,可能是通過降低其表達量減少病毒對LMH細胞的損傷利于病毒復制,后升高是抑制病毒復制。FADV-4感染LMH細胞后,72 h增殖出現高峰后下降,可能是因為LMH細胞免疫應答被激發后INF-α、INF-β、IL-6、IL-8表達量升高,協同抑制FADV-4的復制。提示INF-α、INF-β、IL-6、IL-8在抗FADV-4感染LMH細胞發揮重要作用。

在FADV-4感染LMH細胞后,STING介導的信號通路識別受體,誘導細胞因子和干擾素上調表達,提高免疫應答,抑制FADV-4病毒復制、增殖。這些結果豐富了宿主抵抗FADV-4感染天然免疫應答機理的研究。