益生菌固態發酵料對羔羊斷奶前、后血液免疫、抗氧化指標及糞便消化酶的影響

郭云霞,丁亞偉,徐艷輝,王海玉,李 月,郝慶紅,3*,郄艷菊,段春輝,劉月琴

(1.河北農業大學 生命科學學院,河北 保定 071001;2.河北農業大學 動物科技學院,河北 保定 071001;3.河北省飼用微生物技術創新中心,河北 保定 071001;4.河北省功能性飼料添加劑技術創新中心,河北 石家莊 050000)

斷奶是羔羊生長發育的關鍵階段。斷奶期羔羊飼料結構的轉變及轉群造成的應激等,均會影響羔羊的消化吸收能力,降低機體免疫和抗氧化機能等,極易引發以腹瀉為主要特征的消化道疾病,使其生長受阻甚至死亡,其嚴重制約著養羊業的發展。在應激狀態下,羔羊腸道屏障受損,非特異免疫和特異性免疫激活,IL-1β和TNF-a分泌會顯著上升,炎癥因子可使腸道黏膜發生變化,進而表現相關基因轉錄水平降低[1-2],同時應激促使機體產生的氧自由基,會大大增加機體的應激損傷,產生氧化應激反應。斷奶應激是導致斷奶羔羊腹瀉的主要致病因素,提高機體免疫力和抗應激能力是緩解羔羊斷奶應激的有效措施。

隨著人們對微生物發酵飼料質量的認可及生物技術的迅速發展,發酵飼料在養殖上的應用效果越來越受到人們的重視,也成為飼料行業研究的重要方向。生物發酵飼料可產生多種活性益生菌菌體、蛋白質降解產物及活性小肽等[3],這些小分子活性多肽可緩解大腸桿菌K88(E.coliK88)感染所致的腸道上皮細胞炎癥反應和腸道通透性改變[4],且乳酸菌又可誘導產生Th2細胞因子,白細胞介素-4(IL-4)和白細胞介素-10(IL-10),促使B細胞發育和產生抗體(IgG1、IgE),這些細胞因子在免疫應答誘導和調節中起關鍵作用[5]。發酵飼料可減輕腸道黏膜損傷,緩解幼畜腹瀉發生[6]。啤酒酵母發酵產物可顯著促進肉牛胃腸道消化率,同時提高腸道免疫應答,增強免疫力[7]。在羔羊早期階段添加酵母發酵產物可顯著促進羔羊瘤胃微生物定殖和纖溶潛能,提高羔羊腸道發育和消化率,促進羔羊生長發育[8]。微生物發酵飼料研究多集中于單胃動物,對反芻動物尤其是斷奶前、后羔羊的影響鮮有報道。本試驗以斷奶前、后羔羊為研究對象,通過斷奶前、后補飼發酵飼料,以血液免疫指標、抗氧化指標、生長激素及糞便中酶活為研究目標,以期為發酵飼料在增強機體免疫力和緩解斷奶應激方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料復合益生菌劑:乳酸桿菌RSG-1(≥1.0×108CFU/mL);枯草芽孢桿菌B-1(≥1.0×108CFU/mL);地衣芽孢桿菌Y5-39(≥1.0×108CFU/mL),所有菌株由河北農業大學生命科學學院生物醫藥系分離并保存。玉米、豆粕和麩皮發酵底物購自某飼料公司。45日齡體質量相近哺乳羔羊由衡水志豪畜牧科技有限公司提供。

1.2 益生菌發酵飼料發酵底物由玉米、豆粕和麩皮按60%∶25%∶15%比例配合,乳酸桿菌RSG-1∶枯草芽孢桿菌B-1∶地衣芽孢桿菌Y5-39=1∶1∶4,接菌量10%,含水量45%,室溫(25～30℃)發酵14 d。發酵飼料營養成分為干物質51.40%,粗蛋白19.62%,代謝能12.00%,中性洗滌纖維21.15%,酸性洗滌纖維9.42%,鈣0.76%,磷0.53%。

1.3 羔羊飼養管理及試驗設計選擇45日齡、體質量(12.43±0.22)kg、健康的湖羊哺乳羔羊48只(雌、雄各1/2),60日齡斷奶,按照體質量和性別隨機分為4組,每組12只。試驗設計見表1。預飼期5 d,斷奶前10 d～斷奶后4 d連續飼喂發酵飼料。羔羊斷奶前隨母哺乳并補飼顆粒料,斷奶后轉入羔羊圈,飼料不變。羔羊圈提前進行清掃和消毒,試驗期間羔羊自由采食和飲水,每日07:00和17:00 2次飼喂。參照NRC(2007)版營養需要標準,配制不同的基礎顆粒料,使發酵料組營養水平和對照組營養水平一致,各組飼料配方及營養水平見表2。

表1 各組試驗設計

表2 羔羊顆粒組成及營養水平(干物質基礎) %

1.4 試驗樣品采集及方法

1.4.1樣品采集 分別于斷奶前1 d(斷奶第0天)和斷奶后4 d,空腹采集血樣2份,每份5 mL,其中1份血樣于EDTA抗凝管中,備測血常規;另1份于促凝管中,8 000 r/min離心10 min,收集上層血清,-20℃保存,備測免疫和抗氧化及生長激素等指標。直腸采糞法采集羔羊糞便,備測消化酶活性。

1.4.2測定方法 采用PE-6800全自動血細胞分析儀測定白細胞總數(WBC)、嗜酸粒細胞(NEU)、淋巴細胞(LYM)。

采用江蘇酶免實業有限公司試劑盒按照說明書分別測定白細胞介素1β(IL-1β,檢測范圍3～140 ng/L)、白細胞介素-6(IL-6,檢測范圍 6～180 ng/L)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α,檢測范圍25～1 000 ng/L);免疫球蛋白M(IgM,檢測范圍0.2～18.0 m g/L)、免疫球蛋白G(IgG,檢測范圍50～1 500 mg/L)、免疫球蛋白A(IgA,檢測范圍0.8～30.0 mg/L);生長激素(GH,檢測范圍0.2～8.0 μg/L)、胰島素(insulin,檢測范圍5～80 mIU/L)和胰島素樣生長因子(IGF-1,檢測范圍15～400 μg/L)。

采用江蘇酶免實業有限公司試劑盒按照說明書分別測定谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px,ADS-W-G003)、超氧化物歧化酶活性(SOD,ADS-F-YH001-96)、丙二醛含量(MDA,ADS-F-YH002-96)含量、血清總抗氧化能力(T-AOC,ADS-W-YHKY004-96)。

采用睿信生物科技有限公司試劑盒按照說明書分別檢測糞便消化酶(淀粉酶、胰蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶)的活性。

1.5 數據統計與分析試驗數據采用Excel 2021軟件對數據進行整理,采用SPSS 22.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA),各處理組均值采用Duncan氏多重比較,各處理組與斷奶日齡中交互作用分析采用一般線性模型中多因素方差分析,以P<0.01表示差異極顯著,P<0.05表示為差異顯著,P>0.05為差異不顯著。

2 結果

2.1 益生菌發酵料對羔羊斷奶前、后血液免疫指標的影響由表3可知,與對照組相比,飼喂發酵飼料后WBC數量在斷奶前試驗Ⅰ和Ⅲ組極顯著提高(P<0.01),Ⅱ組極顯著下降(P<0.01)。試驗Ⅱ組極顯著低于其他各組(P<0.01),而試驗Ⅰ與Ⅲ組相比呈顯著增加(P<0.05);斷奶后對照組與發酵料各組間差異不顯著(P>0.05)。隨著發酵飼料的飼喂,對照組和試驗Ⅱ組WBC呈增加趨勢,試驗Ⅰ和Ⅲ組略有下降且差異不顯著(P>0.05),試驗處理與日齡的交互作用差異不顯著(P>0.05)。LYM結果顯示,斷奶前、后發酵飼料各組與對照組差異均不顯著(P>0.05)。NEU結果發現,飼喂發酵料組可使斷奶前試驗Ⅱ組與其他各組相比呈極顯著下降(P<0.01),其他各組間差異不顯著(P>0.05);斷奶后試驗Ⅰ組顯著高于其他處理組(P<0.05),其他各組間差異不顯著(P>0.05);交互作用統計分析發現試驗處理與日齡的交互作用差異不顯著(P>0.05)。

與對照組相比,飼喂發酵料組對斷奶前血清IL-1β含量差異不顯著(P>0.05),斷奶后Ⅲ組極顯著低于其他各組(P<0.01),其他各組間差異不顯著(P>0.05);結果顯示斷奶后羔羊血清IL-1β極顯著高于斷奶前(P<0.01),試驗處理與日齡的交互作用差異極顯著(P<0.01)。飼喂發酵料試驗Ⅲ組對斷奶前血清IL-6呈顯著高于其他各組(P<0.05),其他各組間差異不顯著(P>0.05);斷奶后各組IL-6含量均高于斷奶前,其中試驗Ⅱ組顯著低于對照組(P<0.05),其他各組間差異不顯著(P>0.05)。與對照組相比,TNF-α斷奶前飼喂發酵料試驗Ⅰ和Ⅱ組極顯著降低(P<0.01),而試驗Ⅲ組差異不顯著(P>0.05);斷奶后試驗Ⅰ組顯著下降(P<0.05),而試驗Ⅰ和Ⅱ組極顯著低于Ⅲ組(P<0.01);試驗處理與日齡的交互作用差異不顯著(P>0.05)。

與對照組相比,IgG斷奶前試驗Ⅰ和Ⅱ組極顯著增加(P<0.01),試驗Ⅲ組提高但差異不顯著(P>0.05);斷奶后試驗Ⅰ和Ⅱ組顯著高于對照組(P<0.05),試驗Ⅲ組與對照組相比差異不顯著(P>0.05);隨著斷奶日齡的增加,各處理組IgG含量均呈極顯著下降(P<0.01),但試驗處理和日齡交互作用分析差異不顯著(P>0.05)。IgA斷奶前、后各處理組差異均不顯著(P>0.05)。IgM含量斷奶前試驗Ⅱ組極顯著高于對照組(P<0.01),試驗Ⅱ組顯著高于試驗Ⅰ和Ⅲ組(P<0.05);斷奶后試驗Ⅲ組極顯著高于其他各組(P<0.01),其他各處理組間差異均不顯著(P>0.05);斷奶后IgM均極顯著高于斷奶前(P<0.01),但試驗處理與日齡交互作用差異不顯著(P>0.05)。

表3 益生菌發酵料對羔羊斷奶前、后血液免疫指標的影響

2.2 益生菌發酵料對羔羊斷奶前、后血液抗氧化指標的影響由表4可知,與對照組相比,斷奶前飼喂發酵飼料試驗Ⅰ和Ⅱ組可顯著降低MDA含量(P<0.01),而Ⅲ組差異不顯著(P>0.05);斷奶后試驗Ⅱ組顯著低于其他各組(P<0.05),而其他各組間差異不顯著(P>0.05);斷奶前與斷奶后MDA含量呈極顯著下降(P<0.01),但試驗處理與日齡交互作用差異不顯著(P>0.05)。SOD含量斷奶前試驗Ⅰ和Ⅲ組極顯著高于對照組和試驗Ⅱ組(P<0.01),斷奶后發酵飼料各組均極顯著高于對照組(P<0.01);斷奶后SOD含量極顯著低于斷奶前(P<0.01),但試驗處理與日齡交互作用差異不顯著(P>0.05)。GSH-Px含量在斷奶前Ⅱ組顯著高于對照組和其他處理組(P<0.05),其他各組間差異不顯著(P>0.05);斷奶后Ⅲ組極顯著高于對照組和試驗Ⅰ組(P<0.01),顯著高于Ⅱ組(P<0.05);斷奶后與斷奶前相比呈極顯著增加(P<0.01),但試驗處理與日齡交互作用差異不顯著(P>0.05)。T-AOC含量斷奶前發酵飼料組均極顯著高于對照組(P<0.01),其中試驗Ⅲ組極顯著高于Ⅰ和Ⅱ組(P<0.01);斷奶后試驗Ⅰ和Ⅲ組顯著高于對照組Ⅱ組(P<0.05),斷奶后與斷奶前相比呈極顯著增加(P<0.01),但試驗處理與日齡交互作用差異不顯著(P>0.05)。

表4 益生菌發酵料對羔羊斷奶前、后血液抗氧化指標的影響

2.3 益生菌發酵料對羔羊斷奶前、后血液GH、INS和IGF-1的影響由表5可知,斷奶前飼喂發酵料試驗Ⅰ和Ⅲ組血清GH含量顯著高于對照組和試驗Ⅱ組(P<0.05);斷奶后GH在各處理間差異不顯著(P>0.05);試驗處理與日齡交互作用差異不顯著(P>0.05)。INS含量斷奶期飼喂發酵料各組均極顯著高于對照組(P<0.01),其中Ⅲ組極顯著高于試驗Ⅰ和Ⅱ組(P<0.01);斷奶后飼喂發酵料血清INS在各組呈下降趨勢,其中試驗Ⅰ組極顯著低于對照組(P<0.01),其他各組差異不顯著(P>0.05);試驗處理和日齡交互作用差異不顯著(P>0.05)。IGF-1含量斷奶前試驗Ⅱ和Ⅲ組極顯著高于對照組和試驗Ⅰ組(P<0.01),斷奶后各試驗組間差異不顯著(P>0.05);斷奶后各組極顯著高于斷奶前(P<0.01),試驗處理與日齡差異不顯著(P>0.05)。

表5 益生菌發酵料對羔羊斷奶前、后血液GH、INS和IGF-1含量的影響

2.4 益生菌發酵料對羔羊斷奶前、后糞便消化酶含量的影響由表6可知,斷奶前和斷奶后各發酵料組CL含量極顯著高于對照組(P<0.01),飼喂發酵料斷奶前各組間差異不顯著(P>0.05),斷奶后試驗Ⅲ組顯著高于Ⅱ組(P<0.05);與斷奶前相比,斷奶后試驗Ⅰ和Ⅲ組CL均極顯著增加(P<0.01),試驗處理和日齡交互作用差異不顯著(P>0.05)。α-AL含量斷奶前試驗Ⅰ和Ⅱ組顯著高于對照組(P<0.05),試驗Ⅲ組極顯著高于對照組(P<0.01),試驗Ⅰ組顯著高于Ⅱ組(P<0.05);斷奶后試驗Ⅱ組顯著高于對照組(P<0.05),試驗Ⅲ組極顯著高于對照組(P<0.01);與斷奶前相比,斷奶后極顯著增加(P<0.01),試驗處理和日齡交互作用具有顯著性差異(P<0.01)。LPS含量斷奶前各試驗組極顯著高于對照組(P<0.01),其中試驗Ⅱ組顯著高于試驗Ⅲ組(P<0.05);斷奶后試驗Ⅱ和Ⅲ組極顯著高于對照組和試驗Ⅰ組(P<0.01);斷奶后LPS極顯著高于斷奶前(P<0.01),試驗處理與斷奶日齡呈顯著性相關(P<0.05)。斷奶前、后飼喂發酵料各組Try含量均極顯著高于對照組(P<0.01),其中斷奶前試驗Ⅱ組極顯著高于試驗Ⅰ和Ⅲ組(P<0.01),斷奶后試驗Ⅱ和Ⅲ組極顯著高于對照組和試驗Ⅰ組(P<0.01)。斷奶后Try極顯著高于斷奶前(P<0.01),試驗處理與斷奶日齡呈極顯著性相關(P<0.01)。

表6 益生菌發酵料對羔羊斷奶前、后糞便消化酶的影響

3 討論

3.1 益生菌發酵料對羔羊斷奶前、后血清生理及免疫指標的影響本試驗結果顯示,在斷奶前飼喂10%發酵飼料WBC添加組極顯著低于對照組,5%和15%組極顯著高于對照組,而斷奶后對照組與發酵飼料各組間差異不顯著。NEU在斷奶前10%添加組極顯著低于其他各組,斷奶后差異不顯著。各指標統計分析發現試驗處理與日齡的交互作用差異不顯著。WBC是反映動物機體的炎癥指標,受年齡、品種、日糧、環境等多種外界因素的影響[9]。王娟娟等[10]和黃杏秀等[11]報道,10%發酵飼料組可增加斷奶仔豬血液中白細胞數量和淋巴細胞轉化率,這與本試驗羔羊斷奶前飼喂發酵料5%和15%組WBC升高結果一致,但淋巴細胞數量差異不顯著,這可能與發酵飼料中的乳酸菌、芽孢桿菌及其代謝產物可增加血液中白細胞數量有關[12]。斷奶后對照組和10%添加組WBC具有升高趨勢,而5%和15%組有下降趨勢但差異不顯著,可能是由于斷奶應激引發血清中WBC的變化,斷奶前、后腹瀉羔羊血清中白細胞顯著高于健康羔羊[13-14]。本試驗中10%添加組斷奶前WBC極顯著的低于其他各組,這可能與10%添加組腹瀉率最低有關。

細胞因子為一類在細胞間傳遞信息的蛋白質或小分子多肽,在免疫應答調節和效應中起重要作用[15],輔助性T細胞1型(Th1)細胞因子(IL-1β、IL-2、TNF-α)可激活細胞介導的免疫反應,而Th2細胞因子(IL-4、IL-6和IL-10)可促進B細胞分化增殖,并驅動體液免疫反應[16]。利用復合菌培養物和β-葡聚糖證實可顯著提高肉羊血清中白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6/-8(IL-6/-8)的含量[17]。添加發酵全價料,可顯著增加產蛋雞血清中IL-1β、IL-6和TNF-a的含量[18]。也有報道,飼喂發酵豆粕,不僅顯著提高斷奶犢牛的生長性能,還顯著降低斷奶1 d的犢牛促炎細胞因子、腫瘤壞死因子(TNF-a)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)的含量,在斷奶第3 天TNF-a和 IL-6含量顯著降低,表明發酵豆粕可顯著緩解斷奶應激[19]。試驗結果顯示,IL-1β斷奶后15%發酵料組極顯著低于其他各組;IL-6斷奶前15%添加組顯著高于對照組和其他發酵料組,斷奶后發酵飼料各組均顯著高于斷奶前,且10%添加組顯著低于對照組和其他發酵料組;TNF-α斷奶前5%和10%添加組極顯著低于對照組和15%添加組,斷奶后5%和10%添加組顯著低于對照組和其他各組。結果表明,細胞因子的分泌可能是由于發酵飼料中乳酸桿菌細胞壁中的肽聚糖、磷脂酸等的免疫活性相關[20]。

另外,血清免疫球蛋白濃度可作為動物體液免疫的關鍵指標,其在保護宿主免受致病菌或病毒方面起關鍵作用[21],主要包括IgG、IgM和IgA3種免疫球蛋白種類[22]。據報道,微生物發酵飼料可顯著提高肉羊、肉牛、豬等血清中IgA、IgG和IgM水平[23-25],與本研究結果一致,表明飼喂一定的發酵飼料在一定程度上提高斷奶前、后羔羊的免疫力。

3.2 益生菌發酵料對羔羊斷奶前、后血清抗氧化指標的影響總抗氧化能力可充分反映酶和非酶防御系統的抗氧化能力,抗氧化酶包括SOD和GSH-Px,氧自由基及過氧化氫清除來應對氧化應激損傷,脂質過氧化過程中產生的MDA可以進入細胞,結合入蛋白形成羰基衍生物,發揮細胞毒性作用[26],因此,MDA的濃度可作為判定脂質過氧化的指標。發酵飼料中微生物代謝會產生多種抗氧化復合物,能有效清除自由基[27]。研究表明,日糧中添加發酵飼料可顯著提高仔豬血液中SOD含量,增強機體清除自由基的能力,提高抗應激效果[10]。薛晨[28]證實,微生物發酵飼料可顯著提高肉牛血清中SOD、GSH-Px活性和T-AOC含量,降低MDA含量,增強了抗氧化能力,減少氧化應激的損傷。本研究結果發現,斷奶前、后10%添加組MDA含量均顯著下降,SOD含量斷奶前5%和15%組極顯著增加,斷奶后發酵料組均極顯著高于對照組,GSH-Px活性斷奶前10%添加組顯著高于對照組,斷奶后15%添加組極顯著高于對照組,T-AOC含量斷奶前發酵料組均極顯著高于對照組,而斷奶后5%和15%添加組顯著高于對照組。綜合分析,10%添加組斷奶期可顯著降低體內抗氧化系統破壞,緩解羔羊斷奶應激,增加抗氧化能力。15%斷奶后的抗氧化能力較強,推測可能是由于發酵飼料的添加量大,其中的抗氧化產物及有益微生物更多,使15%添加量在斷奶后呈現較強的抗氧化能力。

3.3 益生菌發酵料對羔羊斷奶前、后血清GH、INS和IGF-1含量的影響生長激素(GH)、胰島素(INS)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)在動物生長發育過程中發揮著重要的作用。GH主要由垂體前葉分泌的單鏈蛋白質激素,通過與靶細胞表面的生長激素受體(GHR)介導,通過不同途徑將信號傳遞到細胞內,從而發揮促進動物生長和調節代謝等多種生物學功能[29]。劉澤等[30]在肉鴨上飼喂復合益生菌發酵料可顯著提高血清中GH、INS和IGF-1的含量。吳先華[31]證實在斷奶仔豬上飼喂發酵豆粕,可顯著提高血清中GH含量。IGF-1是機體內重要的內分泌生長因子,是GH的重要介質。GH可直接激活GHR,刺激IGF-1合成,其作用于靶細胞發揮生長激素的生理功能[32]。飼喂發酵全價料可顯著增加育成豬血清中IGF-1的含量[33],增強CC-AT/增強連接蛋白β與IGF-1啟動子結合,促進IGF-1蛋白在肝臟表達,達到促生長目的[34]。INS是IGF家族中第1個被發現的成員,主要調控血糖平衡。研究發現,利用地衣芽孢桿菌和酵母菌替代莫能菌素可顯著提高育肥羊的生長性能,血清中GH、IGF-1和INS的含量均顯著增加[35]。本研究結果顯示,斷奶前5%和15%添加組GH和INS顯著高于對照組,斷奶后GH在各組間無顯著性差異;INS發酵飼料組顯著低于對照組;斷奶前IGF-1含量10%和15%顯著低于對照組,斷奶后極顯著增加,但與對照組差異不顯著。綜合分析,斷奶前發酵飼料中的消化酶活性可促進營養物質的消化吸收,進而促進羔羊生長,斷奶后受斷奶應激的影響,生長激素呈上升趨勢,但與對照組無顯著性差異,表明發酵飼料可緩解斷奶應激,維持機體穩定。

3.4 益生菌發酵料對羔羊斷奶前、后糞便消化酶指標的影響消化酶在機體營養物質消化吸收過程中起重要作用,主要包括胰蛋白酶(Try)、脂肪酶(LPS)、淀粉酶(AL)和纖維素酶(CL),是確保反芻動物營養物質消化吸收主要消化酶,其活性與機體對營養物質消化利用率密切相關。據報道,復合益生菌發酵以玉米、豆粕和麩皮為發酵底料,飼喂后可顯著提高蛋雞十二指腸食糜AL及空腸食糜Try和LPS活性[36]。糞便消化酶活性可在一定程度上代表腸道消化酶活性。本研究發現,CL、α-AL、LPS和Try等消化酶活性在斷奶前、后發酵飼料各組均顯著高于對照組,斷奶前、后呈顯著性差異,處理和日齡交互作用顯著。消化酶活性增加,可能是由于發酵飼料中抗營養因子的降解刺激消化酶分泌。在微生物發酵飼料過程中,芽孢菌種分泌豐富的水解酶系(Try、AL和CL等),可降低飼料抗原蛋白、植酸、蛋白酶抑制因子和抗性淀粉等抗營養因子的含量[37-39],提升了飼料品質,促進了營養物質消化吸收。同時發酵過程中微生物產生的這些外源消化酶亦可作為內源酶的補充,進而增強了糞便消化酶活性。另外,復合乳酸菌可顯著增加犢牛空腸和回腸胰蛋白酶活性和回腸脂肪酶活性,增強營養物質消化吸收能力[40]。發酵飼料中有益菌的數量顯著增加,可以提高消化酶活性。