羊干擾素α和γ融合表達及抗病毒活性分析

韓 穎,李秀麗,豆子航,郭笑然,雷白時,袁萬哲,2*,趙 款,2*

(1.河北農業大學 動物醫學院,河北 保定 071001;2.河北省獸醫生物技術工程技術創新中心 ,河北 保定 071001)

在養殖業中,抗生素被濫用,導致動物源性食品以及地表生態受到嚴重的污染[1-2],因此急需一些新的綠色環保藥物,使動物源性食品維持綠色健康水平。目前,中國羊養殖行業在逐漸向規模化、集約化的養殖模式發展,多種疾病需要進行防治[3]。

干擾素(IFN)作為一種具有抗病毒、免疫調節、抗腫瘤功能且無殘留、無毒性、無副作用的新型生物制品,在1957年被英國科學家發現,隨后被廣泛研究和應用[4-5]。根據IFN識別受體的不同分為3種類型:Ⅰ型IFN、Ⅱ型IFN、Ⅲ型IFN;根據種屬不同分為不同的亞型,例如:已知人IFN-α有23個以上的亞型,分別以IFN-α1、IFN-α2等表示[6]。綿羊IFN分為3型,目前研究最多的為OviIFN-α、OviIFN-τ和OviIFN-γ以及OviIFN-λ。OviIFN-α和OviIFN-τ屬于Ⅰ型IFN;OviIFN-γ屬于Ⅱ型IFN;OviIFN-λ屬于Ⅲ型IFN[7]。IFN的抗病毒功能不是由IFN直接作用于病毒,是IFN與細胞上相應的受體結合引起的IFN級聯反應所轉錄的ISGs發揮抗病毒作用[8]。以Ⅰ型IFN為例,胞外IFN與細胞表面具有高親和力的IFN受體(IFNAR1)結合,然后與低親和力IFN受體(IFNAR2)形成受體二聚體,受體構象發生改變,形成有活性的三元復合物,引起與受體相關的JAK激酶招募與活化。被激活的JAK激酶催化受體上的酪氨酸殘基發生磷酸化,使信號轉導因子發生磷酸化。被磷酸化的信號轉導蛋白(STAT1、STAT2)脫離受體,在胞漿中形成二聚體,與IFN調節因子9(IRF9)結合,形成激活的異源三聚體轉錄因子復合物(ISGF3),轉移到細胞核中與IFN刺激基因上游啟動子區域的IFN刺激基因反應元件結合(ISRE)刺激ISGs的轉錄,起到抗病毒功能[9-10]。研究比較廣泛的ISGs是OAS、ISG15、Mx、IFITM1[11-14]。

不同的IFN激活的ISGs種類不同,產生的抗病毒效應亦不同,研究發現Ⅰ和Ⅱ型IFN的聯合使用對多種病毒感染具有較好的治療效果[15],體現了一定的協同抗病毒效應[16-17]。因此,本研究擬對羊OviIFN-α和OviIFN-γ基因進行融合表達,以獲得具有疊加效應的抗病毒活性的IFN制劑。本試驗用柔性連接臂(Linker:GGTGGTGGTTCTGGTGGTGGT)將OviIFN-α和OviIFN-γ序列連接構建到原核表達載體pET28a進行表達,重組蛋白rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ純化后用于抗病毒活性檢測,并互相進行比較分析,為重組蛋白生產工業化提供了經驗[18]。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒及主要試劑BL21(DE3)感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司;DMEM培養基、胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司;非洲綠猴腎細胞(Vero)、牛腎細胞(MDBK)、水皰性口炎病毒(VSV)由中國農業科學院上海獸醫研究所惠贈。

1.2 重組羊IFN基因的合成參照GenBank登錄的OviIFN-α序列(登錄號:X59067.1)和OviIFN-γ基因序列(登錄號:NM_001009803.1),使用Codon Adaptation tool(http://www.jcat.de/)進行密碼子優化以及信號肽序列去除 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)。在pET32a載體中選擇酶切位點BamHⅠ和XhoⅠ插入目的序列,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成重組質粒。OviIFN-α F/R:CGCGGATCCTGCGACCTGTCTCAGA/CCGCTCGAGCGGAGAAGACAGGTCA;OviIFN-γ F/R:CGCGGATCCCAGGGTCCGTT-CTTCA/CCGCTCGAGCATA GAAGCACGACG-A。 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1[19-20]。Linker序列:5′-GGTGGTGGTTCTGGTGGTGGT-3′。

1.3 重組質粒的構建及誘導表達用OviIFN-α F和OviIFN-γ R引物將OviIFN-γ/α序列進行擴增,用OviIFN-α F和OviIFN-α R引物將OviIFN-α序列進行擴增,用OviIFN-γ F和OviIFN-γ R引物將OviIFN-γ序列進行擴增,后進行膠回收。將膠回收產物以及pET28a載體用BamHⅠ和XhoⅠ內切酶進行酶切,將酶切后的產物以及線性載體進行酶連。構建pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α、pET-28a-OviIFN-γ/α 3種重組質粒。將重組質粒轉入DH5α感受態并進行鑒定,將陽性菌轉化到大腸桿菌BL21中。鑒定后進行擴大培養,按體積比1∶100接種到新的LB中(含K+),37℃、200 r/min振蕩培養,待D600為0.4～0.6時,加入終濃度1.0 mmol/L 的IPTG,誘導4 h,離心收集菌體,超聲波破碎(360 W、30%、10 min)2次后,分離上清液和沉淀,制備樣品,進行SGS-PAGE檢測,對目的蛋白可溶性進行分析。

1.4 包涵體的純化、復性以及Western blot鑒定收集誘導表達后的菌體,超聲裂解后收集沉淀,沉淀用含2 mol/L尿素的洗滌液洗滌2次,然后將沉淀用10 mL 含8 mol/L尿素的變性液重懸,置冰上2 h直到包涵體溶解。4℃ 10 000r/min離心20 min收集上清,于-80℃保存備用。用His標簽蛋白純化試劑盒純化蛋白,按說明書進行操作。使用羊抗鼠試劑盒進行Western blot試驗。將已經純化復性好的重組蛋白稀釋至1 g/L放置-80℃保存備用。

表1 RT-qPCR引物

1.5 重組蛋白抗病毒活性測定將Vero、MDBK細胞于96孔板中培養至單層,棄去培養液,分別取300 μL制備好的3種重組蛋白用900 μL含2%FBS的DMEM營養液進行4-1～4-9倍比稀釋,每個梯度8個復孔。棄去培養液,每個梯度取100 μL加至96孔板中,于37℃、5% CO2的細胞培養箱中孵育48 h。使用細胞病變抑制法進行測定。在單層細胞上加入用2%FBS的DMEM營養液稀釋至100 TCID50的VSV病毒液100 μL,VSV病毒效價為1×107.45TCID50/mL。設置陰性對照組,于37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養,逐日觀察病變孔數,并通過Reed-Muench法計算重組蛋白的抗病毒活性。

1.6 IFN刺激基因轉錄的水平測定使用能夠完全抑制VSV感染的重組蛋白濃度對MDBK、Vero進行孵育,于6,12,24,48 h收集細胞,采用TRIzol抽提細胞總RNA,將總RNA樣品反轉錄得到cDNA。根據NCBI中的基因序列信息,引用參考文獻中的OAS、IFIT5、Mx、IFITM1特異性引物,選用Gapdh作為內參基因。引物序列見表1。RT-qPCR反應體系20 μL:2×Ague Green qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O 7 μL。反應程序:95℃預變性5 min;95℃變性20 s,58℃退火20 s,72℃延伸20 s,45個循環;進行熔解曲線分析,95℃ 10 s,65℃ 60 s,97℃ 1 s。

1.7 數據的統計與分析通過RT-qPCR檢測后,數據處理采用2-△△Ct法計算。通過IBM SPSS Statistics 26.0軟件,采用t檢驗進行統計學分析,以*0.01

2 結果

2.1 OviIFN-γ/α、OviIFN-α和OviIFN-γ重組質粒的構建利用常規PCR,擴增含有OviIFN-γ/α成熟肽基因的975 bp片段,含有OviIFN-α成熟肽基因的534 bp片段,含有OviIFN-γ成熟肽基因的447 bp片段。將上述PCR擴增產物使用通用引物進行電泳檢測,大小與預期相一致。將片段OviIFN-γ/α、OviIFN-α和OviIFN-γ經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后亞克隆至線性化載體pET28a,構建pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α和pET28a-OviIFN-γ/α,克隆測序結果顯示所構建的3個重組質粒基因序列與設想完全相符,編碼框正確,說明成功構建了pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α和pET28a-OviIFN-γ/α(圖1)。

2.2 包涵體的純化及復性構建成功的pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α和pET28a-OviIFN-γ/α重組質粒,原核表達后進行SDS-PAGE分析表達情況,結果顯示(圖2),3種融合基因在大腸桿菌中都能高效表達,rOviIFN-γ/α、rOviIFN-α和rOviIFN-γ重組蛋白大小為43,26,20 kDa,而誘導的空載體pET28a對照則沒有相應條帶。在當前未進行發酵條件和培養基配方優化的條件下,同樣在1 L發酵液(LB培養基)中經過分離純化后可分別獲得rOviIFN-γ/α 50 mg、rOviIFN-α 40 mg、rOviIFN-γ 40 mg。獲得融合蛋白rOviIFN-γ/α、rOviIFN-α和rOviIFN-γ的包涵體溶液,稀釋復性后采用NanoDrop2000 測定濃度,置于-20℃ 保存。

2.3 純化蛋白表達結果以及蛋白的Western blot檢測如圖3所示,SDS-PAGE結果表明,重組蛋白經過鎳柱純化后,rOviIFN-γ/α、rOviIFN-α和rOviIFN-γ在43,26,20 kDa出現明顯單一的目的蛋白條帶,說明已成功純化出目的蛋白且沒有雜帶。rOviIFN-γ/α的表達量明顯高于rOviIFN-α和rOviIFN-γ,經過Western blot檢測,有明顯的目的條帶。

M．DL2000 DNA Marker;1.pET28a-OviIFN-γ/α;2.pET28a-OviIFN-α;3.pET28a-OviIFN-γ

A.OviIFN-α;B.OviIFN-γ/α;C.OviIFN-γ。M.蛋白Marker;1～6.pET-28a空載未誘導、pET-28a空載誘導、全菌未誘導、沉淀、上清、全菌誘導

A.復性蛋白表達結果;B.復性蛋白的Western blot檢測。M.蛋白Marker;1.pET28a-OviIFN-α;2.pET28a-OviIFN-γ/α;3.pET28a-OviIFN-γ;4.pET28a-OviIFN-α;5.pET28a-OviIFN-γ/α;6.pET28a-OviIFN-γ

2.4 重組蛋白活性檢測應用MDBK/VSV、Vero/VSV系統和細胞病變抑制法測定rOviIFN-γ/α、rOviIFN-α和rOviIFN-γ的活性,以50%細胞病變保護率的最大稀釋度為1單位(U),根據Reed-Muench法計算各種IFN的效價(表2)。檢測結果表明,3種重組IFN與一種聯合用藥方法均表現出顯著的抗病毒活性,能有效抑制VSV對MDBK或Vero細胞的致病作用。通過結果顯示抗病毒活性依次是: rOviIFN-γ/α>rOviIFN-α>rOviIFN-γ,且在MDBK細胞上比在Vero細胞上的活性高。

表2 抗病毒活性檢測 ×104 U/mL

2.5 IFN刺激基因轉錄水平的測定結果以0.6 g/L 的rOviIFN-α、rOviIFN-γ、rOviIFN-γ/α蛋白質量濃度刺激MDBK或Vero細胞,ISGs 在轉錄水平的動態變化如圖 4～6 所示。相比于對照組,重組蛋白顯著增加了 5 種 ISGs 的 mRNA 轉錄水平。以rOviIFN-γ蛋白刺激 MDBK、Vero細胞,ISG15、MX1、OAS和IFITM1 的轉錄水平在 12 h 達到最高水平,與對照組相比差異極顯著(P<0.01),且對2種細胞中4種ISG的轉錄水平進行比較,MDBK細胞中4種ISG的轉錄水平比Vero細胞要高。以rOviIFN-α蛋白刺激 MDBK、Vero細胞,ISG的轉錄水平與對照組在12 h相比差異極顯著(P>0.05),ISG15、MX1、OAS和IFITM1的轉錄水平在12 h達到最高水平。在Vero細胞上進行試驗時,ISG15轉錄水平在6 h達到最高水平。MDBK細胞中4種ISG的轉錄水平比Vero細胞要高。以rOviIFN-γ/α蛋白刺激MDBK、Vero細胞,ISG的轉錄水平與對照組相比在12 h時差異極顯著(P>0.05)。通過結果圖將3種蛋白以及1種蛋白聯合使用方式進行比較,結果顯示ISG轉錄依次是: rOviIFN-γ/α>rOviIFN-α>rOviIFN-γ。

用OviIFN-γ處理Vero和MDBK細胞不同時間,對照組為未經處理的Vero和MDBK細胞,并將GAPDH設為內源性對照,以上數據代表3個獨立試驗(與對照組相比,*表示P<0.050,**表示P<0.010,***表示P<0.001)。下同

圖5 OviIFN-α誘導Vero和MDBK細胞表達MX1、ISG15、IFITM1和OAS

圖6 OviIFN-γ-α誘導Vero和MDBK細胞表達MX1、IFITM1、ISG15和OAS

3 討論

為了研究羊IFN(OviIFN-α、OviIFN-γ)融合表達對抗病毒活性疊加的作用,本試驗構建了pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α和pET28a-OviIFN-γ/α質粒,使用大腸桿菌表達系統進行原核表達,獲得重組IFN。

ECHEBLI等[21]提出在病毒感染過程中的急性或慢性感染階段大多數ISG都能被Ⅰ和Ⅱ型IFN誘導,并表現出最高的增加作用,表明Ⅰ和Ⅱ型IFN之間有很強的協同作用。張小南[22]應用 Affymetrix cDNA 基因芯片技術檢測了Huh7細胞在IFN-α、IFN-γ單獨以及聯合處理6 h后基因表達譜的變化。結果顯示,在IFN聯合處理后,細胞內IFN誘導基因譜有明顯加強,參與抗病毒及免疫反應。通過 RT-PCR 證實, BcIG(Bcl -2 family protein G)、XAFI(X-linked inhibitor of apoptosis associated factor-1)、TRAIL(TNF-related apoptosis inducing ligand)、TAP1(ransporter 1)的轉錄在聯合處理時比IFN-α或IFN-γ單獨處理有極為顯著的加強,說明IFN聯合使用能誘發宿主產生強大的胞內抗病毒活性。

鄭鳴等[23]將豬IFN-α與IFN-γ進行融合表達獲得rPoIFN-α/γ,與PoIFN-α、PoIFN-γ進行抗病毒活性測定,證明經純化復性得到的rPoIFN-α/γ有抗病毒活性,且抗VSV活性rPoIFN-α/γ明顯高于非融合的PoIFN-α、PoIFN-γ,體現了一定的抗病毒疊加效應。本試驗通過細胞病變抑制法將rOviIFN-α、rOviIFN-γ、rOviIFN-γ/α蛋白在2套細胞系統MDBK、Vero中進行試驗,每組試驗組都使用300 μL的重組蛋白進行細胞孵育。較鄭鳴等[23]的試驗設計組,本試驗更充分、更完善,在Vero-VSV系統中,Vero細胞自身并不能表達分泌IFN蛋白,說明在本系統中3組試驗組產生的抗病毒活性與內源性IFN無關。較李丹等[24]等報道的在BHK細胞中進行DviIFN-α抗病毒活性測定有更強的說服力,排除了內源性IFN產生抗病毒作用的可能性。本試驗將IFN聯合使用與IFN融合表達2種方式進行對比,以獲得Ⅰ與Ⅱ型IFN最高的疊加抗病毒活性。rOviIFN-γ/α蛋白的獲得是在整個試驗的上游對OviIFN-α和OviIFN-γ的序列進行改造,通過Linker進行連接獲得,使OviIFN-α和OviIFN-γ起到一定的疊加效應。3組試驗組蛋白用量與所測IFN活性用量一致,取在6,12,24,48 h的Vero和MDBK細胞用1 mL的TRIzol進行RNA的提取,通過RT-qPCR檢測不同細胞、不同時間段中ISG15、MX1、OAS和IFITM1 的轉錄水平,這些ISGs轉錄水平的上調說明了在mRNA水平上這4種ISG表達水平升高。

將rOviIFN-α與rOviIFN-γ 進行聯合使用,采用rOviIFN-α(170 μL)、rOviIFN-γ(130 μL),在MDBK細胞、Vero細胞使用VSV進行抗病毒活性測定,其活性為2.83×104,3.42×104U/mL。通過將單個蛋白進行聯合使用與融合蛋白進行比較,結果顯示聯合使用比融合表達的蛋白抗病毒活性略高,但抗病毒活性仍保持在1個數量級且無明顯差異;并且聯合使用在生產過程中,成本更高,并不利于生產中的應用。因此本試驗將2種蛋白融合表達作為重點進行后續試驗。

綜上所述,rOviIFN-α、rOviIFN-γ、rOviIFN-γ/α蛋白3組試驗組在體外有良好的抗病毒活性,且使ISGs轉錄水平顯著升高,3組試驗組通過抗病毒活性的比較也顯示出了一定的疊加效應。本試驗設置試驗組廣泛、全面,試驗設計的細胞使用種類排除了內源性因素的影響,且該試驗主要集中在體外水平進行評價。