豬主要腹瀉病毒多重RT-PCR檢測方法的建立及初步應用

閆曉光,丁慶文,任豪杰,張宇航,李澤輝,胡 慧,2*

(1.河南農業大學 動物醫學院,河南 鄭州 450002;2.河南省動物性食品安全重點實驗室,河南 鄭州 450002)

在引起豬腸道腹瀉的主要病毒中,豬δ冠狀病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)、豬薩佩羅病毒(porcine sapelovirus,PSV)在豬場中的感染率居高不下,這4種病毒均可引起豬不同程度腹瀉。PDCoV、PEDV、TGEV屬于冠狀病毒,其中PEDV屬于α屬冠狀病毒,常引起仔豬急性腹瀉、脫水和嘔吐等消化道癥狀,死亡率高,自20世紀70年代在歐洲發現后[1],迅速在世界各地擴散開來。本病在國內最初報道于上世紀70年代后期,在2010年底,中國大部分省份暴發與PEDV相似癥狀的急性腹瀉,經證實屬于PEDV強毒株G2型[2]。2013年,美國暴發的PEDV疫情,導致生豬產量下降10%[3]。TGEV屬于α屬冠狀病毒,可感染不同年齡段的豬群,以2周齡以下的仔豬為主,常表現為嘔吐、嚴重腹瀉等消化道癥狀,死亡率高達100%[4]。PDCoV屬于δ屬冠狀病毒,可引起腹瀉、嘔吐等消化道癥狀,死亡率在30%～40%之間,在我國香港于2012年首次發現[5]。本病于2014年在美國暴發了大范圍的流行,隨后在世界其他國家也陸續發現[6-9]。PSV是小RNA病毒科、薩佩羅病毒屬中無囊膜的單股正鏈RNA病毒,呈球形,PSV基因組全長7.5～8.3 kb,是最小的RNA病毒[10]。PSV自1960年在英國首次報道后,世界各地都有發現PSV引起的感染流行。該病毒最初是從呈現嚴重腹瀉癥狀的豬腸道組織中分離得到,命名為豬腸道病毒8型(PEV-8),后經序列分析將其歸類為薩佩羅病毒屬[11]。PSV可感染不同階段的豬,導致腹瀉、肺炎、繁殖障礙等癥狀, 2周齡以下的哺乳仔豬感染后死亡率為100%,5周齡以上的豬死亡率極低[12]。

丁慶文等[13]對臨床上采集的92份糞便樣品進行檢測,發現PEDV、PDCoV和PSV的三者混合感染率為3.26%,PEDV分別與PSV和PDCoV的感染率均在22.00%以上。韋學雷等[14]對采集的176份豬糞便樣品進行檢測發現PEDV、PDCoV和TGEV三者混合感染率為1.13%。針對這4種病毒之間混合感染的現象,通過臨床診斷和病理變化不易區分,需要借助實驗室檢測方法進行鑒別診斷。

目前臨床上常用的診斷方法包括RT-PCR、熒光定量PCR、ELISA等,但沒有發現針對這4種豬主要腹瀉病毒建立的多重RT-PCR檢測方法。本試驗針對PSV、TGEV、PDCoV和PEDV 4種病毒的保守基因片段設計相應的引物,通過對反應條件和體系進行優化,建立了豬主要腹瀉病毒多重RT-PCR檢測方法。并對該方法的特異性、靈敏性和重復性進行試驗。利用建立的檢測方法對臨床上收集的48份病料進行檢測,進一步評價該方法的實用性。試驗旨在為PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的流行病學調查和疾病防控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 病毒及病料樣品來源PDCoV、PEDV、TGEV、PSV和豬細小病毒(porcine parvovirus,PPV)毒株以及豬偽狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)、豬圓環病毒(porcine circovirus,PCV)的陽性病料均是由河南省動物性食品安全重點實驗室鑒定和保存;豬瘟病毒(swine fever virus,CSFV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)疫苗購自哈爾濱維科生物技術公司。病料樣品來自2018—2021年河南、山西和湖南養殖場豬的腸道組織和糞便共48份。

1.2 主要試劑TransZol試劑購自全氏金生物公司;PCR相關試劑、pMD18-T載體、DNA Marker、DNA凝膠回收試劑盒均購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司;質粒抽提純化試劑盒購自美國OMEGA生物技術公司;DMEM液體培養基購自武漢博士德生物工程有限公司;反轉錄試劑盒、組織基因組 DNA提取試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司等。

1.3 引物的設計與合成從GenBank中下載PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的基因序列,通過MEGA軟件進行基因序列比對,針對PSV VP1基因、TGEV M基因、PDCoV N基因和PEDV N基因的保守片段分別設計相應的引物(表1),引物由河南尚亞生物技術有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 病毒核酸的提取以及反轉錄利用TransZol試劑提取PSV、TGEV、PDCoV、PEDV 4種病毒液和CSFV、PRRSV 2種疫苗中的RNA,用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA;將PRV、PCV-2的陽性樣品研磨后,在4℃離心機中離心(5 000 r/min,10 min),吸取上清提取DNA,PPV的病毒液可直接用于DNA的提取。

1.5 陽性標準品的制備分別以PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的cDNA為模板,用相應的引物經過PCR變溫擴增,得到4種病毒的目的片段。反應體系:酶13.0 μL,上、下游引物各0.5 μL,水9.0 μL,模板2.0 μL,共25.0 μL體系。擴增程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,35個循環;72℃ 10 min,4℃保存。用1%瓊脂糖凝膠進行核酸電泳,將膠回收后的產物分別與pMD18-T載體連接,再轉化到DH-5α感受態細胞中,構建重組質粒,并經菌液PCR鑒定,經鑒定正確的重組質粒送往河南尚亞生物技術有限公司進行測序。測序結果比對正確,進行擴大培養,按照質粒提取試劑盒說明書提取質粒。

用紫外分光光度計測出4種病毒的質粒濃度,根據公式:拷貝數=質粒濃度×10-9×6.02×1023/(660×質粒總長度),計算出拷貝數。

1.6 豬主要腹瀉病毒多重RT-PCR檢測方法的建立

1.6.1單一PCR擴增 分別以4種病毒的陽性質粒為模板,參考1.5的PCR反應條件和程序進行擴增,擴增結束后,于1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳。

1.6.2多重RT-PCR反應體系和條件的優化 以混合的4種陽性質粒為模板,參考1.5的PCR反應條件和程序,進行退火溫度的優化(50,52,54,56,58,60℃),對4種病毒引物不同終濃度之間的組合(0.25,0.50,0.75 μmol/L)進行篩選,確定優化后的多重RT-PCR反應體系和條件。

1.6.3多重RT-PCR檢測方法的特異性試驗 分別以PSV、TGEV、PDCoV、PEDV、CSFV、PRRSV的cDNA 和PPV、PRV、PCV-2的DNA為模板,用1.6.2確定后的反應條件和體系進行PCR擴增,同時設置陰性對照,判斷該方法的特異性。

1.6.4多重RT-PCR檢測方法的靈敏性試驗 將4種陽性質粒混合,進行10倍倍比稀釋,以稀釋后的混合陽性質粒(109～100拷貝/μL)為模板,用1.6.2確定后的反應條件和體系進行PCR擴增,評價該方法的靈敏性。

1.6.5多重RT-PCR檢測方法的重復性試驗 分別以104拷貝/μL的混合陽性質粒和4種單一陽性質粒為模板,用1.6.2確定后的反應條件和體系進行PCR擴增,重復3次(每間隔3 d重復1次),評價該方法的重復性。

1.6.6臨床樣品檢測 對采集的48份臨床病料進行預處理,糞便用DMEM稀釋,進行震蕩,在4℃離心機中離心;對于腸道組織的處理,在EP管中依次加入小鋼珠、DMEM和黃豆大小的組織塊,再在機器上進行碾磨,于4℃離心機中離心(5 000 r/min,10 min),取上清,用TRIzol 裂解法對樣品中的RNA進行提取,反轉錄cDNA,進行PCR擴增。利用建立的多重RT-PCR和單一RT-PCR檢測方法對臨床樣品進行檢測,根據檢測結果計算兩者的符合率。

2 結果

2.1 單一PCR擴增結果及陽性質粒的鑒定分別以PDCoV、PEDV、TGEV、PSV 4種病毒的陽性質粒為模板,用1.5中的反應體系和條件,進行普通PCR 擴增,PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳。結果顯示,均擴增出與目的片段大小一致的條帶(圖1),將質粒送往相關公司進行測序,序列比對均正確,表明成功構建了4種病毒的陽性質粒。

M.DL700 DNA Marker;1～4:PDCoV、PEDV、TGEV、PSV;N.陰性對照

2.2 多重RT-PCR反應體系和條件的優化通過對不同退火溫度(圖2)和4種引物不同濃度的組合(圖3)進行篩選,確定多重PCR的反應體系為2×Taq DNA Master Mix 15.00 μL,PSV-F/R(10 μmol/L)各0.50 μL,TGEV-F/R(10 μmol/L)各0.25 μL,PDCoV-F/R(10 μmol/L)各0.25 μL,PEDV-F/R(10 μmol/L)各0.25 μL,cDNA為2.00 μL,補水至25.00 μL。最終確定的反應條件為95℃ 5 min;95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,35個循環;72℃ 10 min,4℃結束反應。

2.3 多重RT-PCR檢測方法的特異性試驗分別以PSV、TGEV、PDCoV、PEDV、CSFV、PRRSV的cDNA 以及PPV、PRV、PCV-2的DNA為模板,進行PCR擴增,同時設置陰性對照。結果顯示,該方法能夠擴增出PSV、TGEV、PDCoV、PEDV的目的基因,同時與CSFV、PRRSV、PPV、PRV、PCV-2無交叉反應,證明該方法特異性良好(圖4)。

M.DL700 DNA Marker;1～6.退火溫度依次為50,52,54,56,58,60℃;N.陰性對照

M.DL700 DNA Marker;1～3.PEDV、PDCoV均為0.25 μmol/L,TGEV為0.25 μmol/L,PSV為0.25,0.50,0.75 μmol/L;4～6.PEDV、PDCoV均為0.25 μmol/L,TGEV為0.50 μmol/L,PSV為0.25,0.50,0.75 μmol/L;7～9.PEDV、PDCoV均為0.25 μmol/L,TGEV為0.75 μmol/L,PSV引物終濃度依次為0.25,0.50,0.75 μmol/L;N.陰性對照

M.DL700 DNA Marker;1.混合的4種陽性質粒;2～5.PSV、TGEV、PDCoV、PEDV的陽性質粒;6～10.PRV、PCV、PPV、PRRSV、CSFV;N.陰性對照

2.4 多重RT-PCR檢測方法的靈敏性試驗將同一濃度的4種陽性質粒混合,進行10倍倍比稀釋,以稀釋后的陽性質粒(109～100拷貝/μL)為模板,進行PCR擴增。結果顯示,該檢測方法對PSV、TGEV、PDCoV、PEDV的靈敏性分別為1.37×102,1.44×102,1.51×102和1.56×102拷貝/μL(圖5),證明本試驗建立的多重RT-PCR檢測方法靈敏性較高。

M．DL700 DNA Marker;1～10.依次為109～100 拷貝/μL陽性質粒的PCR擴增;N.陰性對照

2.5 多重RT-PCR檢測方法的重復性試驗分別以104拷貝/μL的混合陽性質粒和4種單一陽性質粒為模板,進行PCR擴增,重復3次(每間隔3 d重復1次)。結果顯示,該方法重復性良好(圖6)。

2.6 臨床樣品檢測利用建立的檢測方法對收集的48份臨床病料進行檢測,多重RT-PCR檢測出PSV、TGEV、PDCoV、PEDV的陽性樣品分別有2,0,7,11份,單一RT-PCR檢測出PSV、TGEV、PDCoV、PEDV的陽性樣品分別有3,2,9,12份,2種檢測方法的總符合率為91.66%(表2)。選擇了2個陽性樣品的PCR產物進行克隆測序,通過同源性分析,發現6#陽性樣品的基因序列與參考PEDV毒株序列同源性范圍在98.7%～99.1%之間(表3),29#陽性樣品的基因序列與參考PDCoV毒株序列同源性范圍在99.1%～100.0%之間(表4),測序結果證明該檢測方法可特異性擴增出病毒的目的基因。本試驗建立的多重RT-PCR檢測方法可用于臨床上對PSV、TGEV、PDCoV、PEDV的檢測。

A.第1次;B.第2次;C.第3次。M.DL700 DNA Marker;1.混合的4種陽性質粒;2～5.PSV、TGEV、PDCoV、PEDV各單一陽性質粒;N.陰性對照

表2 臨床樣品檢測結果

表3 PEDV同源性分析 %

表4 PDCoV同源性分析 %

3 討論

豬腹瀉病毒在我國流行時間長,造成的經濟損失難以估量。PSV、TGEV、PDCoV、PEDV均可引起豬腸道腹瀉,臨床癥狀相似,難以區分。目前檢測方法有病毒分離、ELISA、q-PCR、RT-PCR、RPA等。病毒分離培養對試驗操作要求比較高,需要用特定的細胞系來進行分離培養,耗時長,同時要求無菌環境,不適用于臨床快速診斷。ELISA是利用抗原和抗體特異性結合的特性進行檢測,但由于需要制備專一的抗體,花費時間長,在檢測過程中速度較慢,操作步驟較多不適用于快速檢測。恒溫擴增技術可以在某個恒定溫度下大量擴增病毒核酸,相比于聚合酶鏈式反應,無需改變樣品溫度,操作簡便,結果可視化,由于對引物和靶標序列的選擇性要求比較高,導致其應用范圍受限制。多重RT-PCR可一次性檢測多種病毒,同時成本和操作技術相對較低。因此,多重RT-PCR在檢測病毒混合感染方面應用比較廣泛。

本試驗建立的多重RT-PCR檢測方法,基于PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的保守片段設計了4對引物。在PCR擴增過程中,引物的設計是至關重要,首先對設計出的引物進行篩選,保證引物之間不會出現同源性和互補現象,對篩選出的引物進行比對,要初步確保依據該引物建立的檢測方法具有良好特異性;驗證單個引物能否擴增出目的片段,再通過篩選出的引物進行組合,看能否同時擴增出4種病毒的目的片段,接著摸索最佳引物濃度以及退火溫度,建立豬主要腹瀉病毒多重RT-PCR檢測方法。該檢測方法可擴增出PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的目的基因,對CSFV、PRRSV、PPV、PRV和PCV-2無交叉反應,該方法特異性良好。韋學雷等[14]針對TGEV、PDCoV和PEDV建立的三重RT-PCR檢測方法,對TGEV、PDCoV和PEDV的檢測限分別為3.68×102,3.14×103和3.88×104拷貝/μL。本試驗建立的檢測方法對PSV、TGEV、PDCoV、PEDV的檢測限分別為1.37×102,1.44×102,1.51×102和1.56×102拷貝/μL,比上述檢測方法靈敏度高。

利用本試驗建立的檢測方法對臨床上收集的48份樣品進行檢測,共檢測出2份PSV、7份PDCoV和11份PEDV,與單重RT-PCR檢測結果的總符合率為91.66%。根據臨床檢測結果,發現豬場中PEDV感染率最高,并且還存在著病毒混合感染的現象,2份病料呈現PSV和PDCoV混合感染,3份病料呈現PEDV和PDCoV混合感染。通過對其中2份陽性樣品的PCR產物進行克隆測序,測序結果發現6#樣品和29#樣品分別為PEDV感染和PDCoV感染,與檢測結果相符合。

綜上所述,本試驗成功建立用于檢測PSV、TGEV、PDCoV和PEDV 4種豬主要腹瀉病毒多重RT-PCR檢測方法,該方法具有良好的特異性和靈敏性,為臨床上對這4種病毒的檢測和流行病學調查提供了技術保障。