基于牛呼吸道合胞體病毒F基因TB GreenⅡ熒光定量PCR檢測方法的建立

郭 兵,王海鳳,李 妍,張 玥,陳 彪,秦建華*

(1.河北農業大學 動物醫學院 農業農村部奶牛健康養殖重點實驗室(部省共建),河北 保定 071000;2.河北北方學院 動物科技學院,河北 張家口 075000)

牛呼吸道合胞體病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)是世界范圍內引起牛呼吸道疾病綜合征的重要病原之一,是導致牛下呼吸道感染的首要原因[[1-2]。感染牛臨床可見鼻腔和眼睛分泌物滲出、發熱、咳嗽、氣喘和呼吸困難等癥狀[3],病死牛剖檢可見不可逆性肺損傷如肺水腫、肺氣腫和間質性肺炎等病理性變化[4]。牛感染BRSV后,病毒長期存在于體內引起持續感染,使牛的免疫力下降,最終導致牛呼吸道合胞體病暴發[5]。該病發病率高,死亡率低,但受到外界因素(溫度、斷奶和混群等)刺激死亡率明顯升高,給養牛業帶來巨大經濟損失,是養牛業面臨的重大難題[6]。臨床上BRSV的一些非典型癥狀常與牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)和牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)等病原感染引起的臨床癥狀極為相似,給臨床診斷帶來難度[7],因此建立有效的BRSV檢測方法對牛呼吸道合胞病的防控具有重要意義。

國內外已建立的BRSV定量檢測方法靶基因均為N基因。韋佳塔等[8]針對BRSV N 基因建立了熒光定量PCR檢測方法,UEHARA等[9]建立了針對N基因的液滴-實時熒光定量PCR方法。然而,隨著病毒不斷發生變異,上述檢測技術亦受到了挑戰。BRSV F蛋白介導宿主細胞與病毒的融合,增強病毒的穿透力,將核衣殼傳遞到細胞質中[10],還可以促進受感染細胞和臨近細胞的結合進而形成合胞體,誘導機體產生體液免疫應答[11]。F蛋白具有高度的穩定性,不同毒株間的部分序列分析表明核苷酸和氨基酸變異程度分別為0.8%和1.8%[12]。國外早在1994年已有以F基因作為目的基因建立巢氏PCR診斷方法的報道[13],國內史鴻飛等[14]針對BRSV融合蛋白F基因建立了套式RT-PCR方法,但國內、外以F基因建立的檢測方法均不能進行定量檢測。

綜上,本研究針對BRSV F基因高度保守區建立TB Green Ⅱ 熒光定量PCR檢測方法,以期增加該病毒檢測的候選基因,為牛呼吸道合胞體病的防控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 病毒cDNA和臨床被檢樣品及主要試劑IBRV cDNA、BVDV cDNA,從鼻拭子、抗凝血和肺臟組織勻漿3種樣品中分離鑒定的BRSV cDNA,均由本實驗室保存;50份出現明顯臨床癥狀疑似感染BRSV病牛的抗凝血、鼻拭子和死亡牛只的肺臟樣品采集于河北省高寒地區(張北、尚義和康保縣)養牛場;TB Green Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、pMDTM19-T Vector Cloning Kit和反轉錄試劑盒購自寶生物技術(北京)有限公司;病毒基因組RNA提取試劑盒購自廣州飛揚生物工程有限公司。

1.2 引物的設計與合成參考GenBank中BRSV(M58350.1、MN316656.1、AJ971803.1)核酸序列,選擇F基因設計熒光定量PCR特異性引物,引物序列F:5′-AGTTGACACTGTATCCGTTGG-3′;R:5′-ACTCATCGGAAGGAAACA-3′,擴增長度為125 bp,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 重組質粒的制備以BRSV的 cDNA為模板,用設計的特異性引物進行BRSV目的片段擴增;將瓊脂糖凝膠回收的目的片段與pMD19-T載體連接后轉化至DH5α感受態細胞,重組質粒命名為pMD19T-BRSV-gF;挑取白色單菌落增菌培養后提取質粒,用限制性內切酶XbaⅠ和Sal Ⅰ進行雙酶切鑒定(目的基因為125 bp,質粒為2 692 bp);對雙酶切鑒定正確的重組質粒進一步做測序鑒定;將上述鑒定正確的重組質粒作為繪制BRSV標準曲線的模板;用酶標儀測定測重組質粒濃度和純度,計算拷貝數,公式為:拷貝數=質粒濃度×6.02 × 1023×10-9/(660×質粒長度)。

1.4 TB Green Ⅱ熒光定量PCR反應條件優化分別設置51,52,53,54,55,56,57℃作為退火溫度優化反應條件,分析擴增曲線,確定最佳退火溫度;運用優化后的退火溫度,設置0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 μL 進行引物體積摸索,確定反應的最佳引物量,反應結束后制作熔解曲線。

1.5 熒光定量PCR標準曲線的建立將BRSV重組質粒作10倍梯度稀釋,選取6個連續稀釋濃度質粒(3.9×101～3.9×106copies/μL)作為模板,每個濃度設3個重復,以ddH2O作為陰性對照,以1.4優化后的反應體系和條件進行熒光定量PCR擴增,反應結束后繪制標準曲線。

1.6 敏感性試驗將BRSV重組質粒作10倍梯度稀釋,選取6個連續稀釋濃度質粒(3.9×101～3.9×106copies/μL)作為模板,每個濃度做3個重復,以ddH2O作為陰性對照,進行熒光定量PCR 擴增,通過觀察熒光擴增曲線獲得BRSV重組質粒最低檢出濃度。

1.7 特異性試驗采用建立的熒光定量PCR方法分別對BRSV、BVDV和IBRV 的cDNA進行擴增,同時設ddH2O為陰性對照,通過觀察PCR擴增曲線評價所建方法的特異性,被檢樣品出現典型的“S”型擴增曲線判為陽性,無明顯擴增曲線判為陰性。

1.8 重復性試驗選取4個連續稀釋濃度BRSV重組質粒 (3.9×103～3.9×106copies/μL) 作為模板,用熒光定量PCR方法進行批內和批間重復試驗,每個濃度設3個重復,統計Cq 值并計算標準差,通過對變異系數(CV)分析評估所建方法重復性。

1.9 臨床樣品的檢測按照RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒說明書對50份抗凝血、鼻拭子和肺臟臨床樣品進行BRSV RNA提取和cDNA 反轉錄。利用熒光定量PCR方法和常規PCR方法(黑龍江省地方標準,DB23/T)進行BRSV病原檢測,比較2種方法的陽性檢出率和符合率。

2 結果

2.1 重組質粒的構建構建的重組質粒經XbaⅠ和SalⅠ雙酶切后,凝膠電泳得到約125 bp片段,與預期目的基因片段大小相符,且載體片段與理論值相符(2 692 bp)(圖1);經BLAST檢索,與GenBank中參考序列一致,說明BRSV重組質粒構建成功。重組質粒質量濃度為120.4 mg/L,根據公式計算得出重組質粒拷貝數為3.9×1010copies/μL。

2.2 熒光定量PCR反應條件的優化通過對退火溫度和引物體積優化,確定TB Green Ⅱ熒光定量PCR方法反應體系:TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (2 ×)10.0 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,模板2.0 μL,ROX Reference Dye Ⅱ (50×) 0.4 μL,ddH2O 6.0 μL。BRSV熔解曲線溫度為83℃,最佳擴增條件:預變性95℃ 30 s;95℃ 5 s,55℃ 34 s,共40個循環(圖2)。

M.DL2000 DNA Marker;1.pMD19T-BRSV-gF雙酶切產物;2.陰性對照

A.51～57℃退火溫度時的擴增曲線;B.51～57℃退火溫度時的融解曲線;C.上、下游引物各0.8 μL時的擴增曲線;D.上、下游引物各0.8 μL時的融解曲線;紅色箭頭.最優條件

2.3 熒光定量PCR標準曲線的建立以梯度稀釋的BRSV重組質粒為模板,進行熒光定量PCR擴增,建立標準曲線(圖3)。重組質粒模板拷貝數在3.9×101～3.9×106copies/μL范圍內,與Cq值呈現良好的線性關系。標準曲線斜率為-3.256 1,相應的回歸方程為y=-3.256 1x+32.338 0,相關系數R2=0.995 2,擴增率為103%。

圖3 熒光定量PCR標準曲線

2.4 熒光定量PCR敏感性試驗選取6個連續稀釋濃度質粒(3.9×101～3.9×106copies/μL)為模板進行熒光定量PCR擴增,BRSV重組質粒出現良好的S型熒光擴增曲線,陰性對照組無擴增曲線,BRSV重組質粒的最低檢出濃度達3.9×101copies/μL(圖4)。

1～6.質粒濃度依次為3.9×101～3.9×106 copies/μL;7.陰性對照

2.5 熒光定量PCR特異性試驗利用建立的熒光定量PCR方法對IBRV、BVDV和BRSV的cDNA進行檢測,從鼻拭子、抗凝血和肺臟組織勻漿3種樣品中分離出的BRSV cDNA 均擴增出典型的“S”型擴增曲線,IBRV cDNA、BVDV cDNA和陰性對照均無特異性擴增(圖5)。

1.鼻拭子BRSV擴增曲線;2.肺臟組織勻漿BRSV擴增曲線;3.抗凝血BRSV擴增曲線;4.BVDV擴增曲線;5.IBRV擴增曲線;6.陰性對照組擴增曲線

2.6 熒光定量PCR重復性試驗用熒光定量PCR方法對4個濃度(3.9×103～3.9×106copies/μL)的BRSV重組質粒進行批內和批間重復試驗(表1),批內Cq 值的CV為0.7%～1.9%,批間Cq 值的CV為0.9%～1.8%,均小于2.0%。

2.7 臨床樣品檢測用建立的熒光定量PCR方法和常規PCR方法對50份臨床樣品進行檢測,熒光定量PCR對BRSV的陽性檢出率為26%(13/50),常規PCR陽性檢出率為14%(7/50),2種方法總符合率為88%(44/50),陽性符合率為100%(7/7),陰性符合率86%(37/43) (表2)。

表1 熒光定量PCR重復性試驗

表2 臨床樣品檢測結果

3 討論

熒光定量PCR技術利用熒光信號的變化實時監測PCR反應過程,通過標準曲線對未知模板進行定量分析。該技術靈敏性較高,特異性較強,近年來廣泛應用于畜禽病原的檢測[15-16]。常用的熒光定量PCR方法有熒光標記探針法和熒光染料法,探針法需要合成探針,費用昂貴;染料法無需合成探針,操作簡單,檢測成本較低,臨床應用更為廣泛。TB Green Ⅱ熒光染料對雙螺旋DNA的結合高度專一,能很好地抑制cDNA中殘存的mRNA活性,避免mRNA對PCR反應的影響,是常用的一種熒光染料。

因此,本研究以TB Green Ⅱ為熒光染料,選擇BRSV 的F基因設計特異性引物,通過優化反應體系和反應條件,成功建立熒光定量PCR方法。特異性試驗中選擇臨床癥狀容易混淆的BVDV和IBRV作為陽性對照,結果顯示在肺臟組織勻漿、鼻拭子和抗凝血3種樣品中均特異性檢測出BRSV,BVDV和IBRV檢測均為陰性,說明本方法對BRSV特異性較高。批內和批間重復性試驗的CV均小于2%,該方法具有良好的重復性和可操作性。本研究建立的熒光定量PCR檢測方法對BRSV的最低檢測限可達3.9×101copies/μL,與趙毅[17]建立的熒光定量PCR檢測方法(BRSV最低檢出限為1.02×102copies/μL),姜曉霞等[18]建立的實時熒光定量PCR方法(BRSV最低檢出限1.02×102copies/μL)和魏碩佟等[19]建立的BRSV多重PCR方法(BRSV最低檢測限1.0×104copies/μL)相比,敏感性更好,分別提高了2.5,2.5,256.4倍。采用熒光定量PCR和常規PCR方法對50份采集樣品進行檢測,結果顯示熒光定量PCR 對BRSV陽性檢出率(26%)明顯優于常規PCR(14%),陽性符合率為100%,能夠滿足BRSV臨床檢測的要求。

綜上所述,本研究建立的熒光定量PCR檢測方法可應用于臨床檢測中,為臨床上選擇合適的BRSV檢測方法提供參考以及對牛呼吸道合胞體病的流行病學調查和防控提供技術支持。